Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero

Resumo

Este protocolo descreve a produção de KLRG1 tetrâmero, que é uma ferramenta poderosa para a análise de KLRG1 ligantes.

Resumo

Assassino celular G1 receptor lectina-like (KLRG1) é um tipo de receptor da glicoproteína transmembrana II inibitória pertencentes à superfamília tipo C lectina-like. KLRG1 existe tanto como um monômero e como um homodímero dissulfeto ligadas. Este receptor bem conservada é encontrada na maioria das células maduras e recentemente activado NK, bem como em um subconjunto de células T efetoras / memória.

Usando KLRG1 tetrâmero, bem como outros métodos, E, N, e R-caderinas foram identificados como KLRG1 ligantes. Estes Ca ^{2 +} dependentes de célula-célula de moléculas de adesão compreende um domínio extracelular contendo cinco repetições caderina responsável por interações célula-célula, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que está ligada ao citoesqueleto de actina.

Geração do tetrâmero KLRG1 foi essencial para a identificação do KLRG1 ligantes. KLRG1 tetrâmero é também uma ferramenta única para elucidar a caderina papéis e jogar KLRG1 na regulação da resposta imune e integridade do tecido.

Protocolo

Preparação de Corpos de Inclusão

1. Inocular 4 x 500 ml frascos de TB, cada uma contendo 50 mg / ml de cloranfenicol carbenicilina e com uma cultura de bactérias durante a noite expressando a construir KLRG1 plasmídeo. Quando o OD atinge 0,6 Å a 600 nm, induzir com a adição de 0,4 M IPTG e incubar a cultura para um adicional de 4 horas agitação a 37 ° C.
2. Ressuspender as células colhidas em pH = 8,0 ressuspensão (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets podem ser congeladas nesta fase.
3. Piscina não mais que 60 ml de resuspensions bacteriana em um copo de polipropileno. Se necessário, ajustar para 60 ml co....

Discussão

Neste protocolo, é mostrado como purificar, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrâmero pode ser usado para rotular KLRG1 ligantes por citometria de fluxo. Embora as condições refolding terá de ser testado empiricamente para cada proteína, outras lectinas tipo C pode ser tetramerized usando um protocolo similar. Uso de proteínas tetramerized como sondas, ligantes para receptores órfão tipo C lectina poderia ser identificado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Enzima e Tampão BirA	Kit de Biotinilação	Avidity	BIRA500
Comprimidos Completos de Inibidor de Protease, sem EDTA	Reagente	Roche Group	11 836 170 001	ou equivalente
Célula Agitada Amicon	Equipamento	EMD Millipore	Modelo #8400	ou equivalente
Membrana de ultrafiltração YM10 NMWL 10K	Material para Filtração	EMD Millipore	13642
Concentrador de 15 ml YM10	Material para Filtração	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipamento	GE Healthcare	18-1900-26
Coluna de alta resolução Sephacryl S-200 16/60	Equipamento	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidina PE	Reagente	BD Biosciences	554061	ou equivalente