Несоответствие изображений Ремонт и клеточных реакций на повреждение ДНК в Сенная Bacillus</em

Summary

Подробный протокол описан для визуализации реального времени формирования комплексов репарации ДНК в<em> Сенная Bacillus</em> Клеток.

Abstract

Оба прокариоты и эукариоты ответ на повреждение ДНК через сложный набор физиологических изменений. Изменения в экспрессии генов, перераспределения существующих белков и сборку новых белковых комплексов можно стимулировать с помощью различных повреждений ДНК и несовпадающих пар оснований ДНК. Люминесцентной микроскопии был использован в качестве мощного экспериментального инструмент для визуализации и количественной оценки этих и других ответов на повреждения ДНК и контролировать состояние репликации ДНК в комплексе архитектуры субклеточных живой клетке. Поступательное слияния между флуоресцентных белков репортер и компоненты репликации ДНК и ремонт техники были использованы для определения сигналов, предназначенных для восстановления ДНК белков на их родственные поражения<em> В естественных условиях</em> И понять, как эти белки организованы в бактериальных клетках. Кроме того, транскрипции и трансляции слияния связаны с ДНК промоутеров повреждения индуцибельной показали, какие клетки в популяции активировали генотоксического ответы стресса. В этом обзоре мы предлагаем подробный протокол для использования флуоресцентной микроскопии для изображения сборки репарации ДНК и репликации ДНК комплексов в одной бактериальной клетки. В частности, эта работа направлена ​​на несоответствие изображения ремонт белков, гомологичной рекомбинации, репликации ДНК и SOS-индуцируемого белка в<em> Сенная Bacillus</em>. Все процедуры, описанные здесь, легко поддается для работы с изображениями белковых комплексов в различных видов бактерий.

Protocol

Рост культур клеток для микроскопии 1. Один или два дня до визуализации, подготовки B. Сенная штамм содержащие поступательного белка слияния вы хотите визуализировать. Судебная раундов шаги 1А и 1В будет необходимо определить, какой рост условие обеспечивает лучшие и?…

Discussion

Методом проб и ошибок требуется найти воздействия условий для высокого качества изображения для каждого штамма, мы находим, что 1 миллисекунду подходит для белых изображений света, в то время как воздействие от 100 до 2000 мс подходят для GFP (FITC) и FM4-64 (TRITC ) изображения. Экспозиция будет меня?…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize