Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Resumo

Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA em Bacillus subtilis Células.

Resumo

Ambos os procariotas e eucariotas responder a danos no DNA através de um complexo conjunto de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição de proteínas existentes, ea montagem de complexos de proteínas novo pode ser estimulada por uma variedade de lesões de DNA e de pares de bases incompatíveis DNA. Microscopia de fluorescência tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta experimental para visualizar e quantificar as respostas para essas e outras lesões de DNA e para monitorar o status de replicação de DNA dentro da complexa arquitetura subcelular de uma célula viva. Fusões de translação entre proteínas fluorescentes e componentes repórter da replicação do DNA e máquinas de reparação têm sido usados ​​para determinar as sugestões que visam as proteínas do reparo do DNA de suas lesões cognate

Protocolo

Culturas em crescimento de células para microscopia

1. Um ou dois dias antes da imagem, prepare o B. subtilis cepa contendo a proteína de fusão traducional você deseja visualizar. Rounds julgamento de passos 1A e 1B será necessário determinar qual condição de crescimento fornece as melhores imagens da sua estirpe. Na maioria dos casos, as células devem ser trabalhada durante a fase de crescimento exponencial.

1. Para alguns B. subtilis cepas (em particular, cepas que crescem pouco devido à integração da fusão de translação entre o gene de interesse e GFP em seu lócus endógeno), o crescimento inicia....

Discussão

Tentativa e erro são necessários para encontrar as condições de exposição de imagens da mais alta qualidade para cada cepa, e supomos que 1 milissegundo é apropriado para imagens com luz branca, enquanto exposições de 100 a 2000 ms são apropriados para GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) imagens. Tempo de exposição vai variar dependendo do equipamento de imagem utilizada. Recomendamos o uso de uma cepa por 15 bem-lâmina de microscópio para a imagem mais simples, como a qualidade pad e difusão de células da fronteira pad pode c.......

Materiais

Receitas específicas solução ^1:

10x S7 ₅₀ sais
0,5 M MOPS
100 Sulfato de Amônio mM
50 mM fosfato de potássio monobásico
Filtro de esterilizar, e enrole S7 ₅₀ media em folha antes do armazenamento

Metais 100x
0,2 M MgCl ₂
70 mM CaCl ₂
5 mM MnCl ₂
0,1 mM ZnCl ₂
100 mcg / mL Tiamina HCl
2 mM HCl
0,5 mM FeCl ₃ *
dH ₂ O para volume final
* FeCl ₃ deve ser adicionado por último, para evitar precipitação.
Após a esterilização do filtro, embrulhe solução de metal em folha de 100x.

S7 ₅₀ media
1x S7 ₅₀ sais
1x de Metal
A glicose 1%
O glutamato 0,1%
40 mcg / mL Triptofano
40 mcg / mL Fenilalanina
H ₂ O destilada para volume final

Spizizens 10x (g / L)
151,4 mM Sulfato de Amônio (20g / L)
803,8 mM fosfato de potássio monobásico (140g / L)
440,9 mM de potássio dibásico (60g / L)
34,0 mM citrato de sódio (10g / L)
16,6 mM MgSO ₄ (2g / L)
dH ₂ O para volume final
Filtro de esterilizar