कैनेटीक्स और संरचना समारोह विश्लेषण में आत्मीयता निर्धारण के लिए सही प्रोटीन एकाग्रता का महत्व

Summary

हम लागू लेबल मुक्त प्रोटीन बातचीत विश्लेषण का उपयोग कई cystatin बी म्यूटेंट के लिए बाध्य गतिज लक्षण वर्णन के माध्यम से papain का विश्लेषण संरचना समारोह के लिए Biacore X100. अंशांकन मुक्त एकाग्रता विश्लेषण (CFCA) बनाए रखा बाध्यकारी गतिविधि के साथ एक मानक वक्र के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन की एकाग्रता के उपाय. हम सांद्रता की कि पुष्टिकरण का उपयोग CFCA गतिज विश्लेषण की विश्वसनीयता बढ़ जाती है और कि गतिज स्थिरांक मज़बूती से निर्धारित किया है भले ही एक पुनः संयोजक प्रोटीन की गतिविधि कम है किया जा सकता है दिखाते हैं.

Abstract

इस अध्ययन में, हम वास्तविक समय लेबल मुक्त विश्लेषण का उपयोग Biacore X100 द्वारा गोजातीय सिस्टीन protease अवरोध करनेवाला cystatin बी और papain (1 छवि), एक संयंत्र सिस्टीन protease के एक catalytically निष्क्रिय फार्म के बीच बातचीत का पता लगाने. Papain के साथ बातचीत के क्षेत्रों में बिंदु उत्परिवर्तन के साथ कई cystatin बी वेरिएंट का उत्पादन कर रहे हैं. प्रत्येक cystatin बी संस्करण के लिए हम अपनी विशिष्ट बंधनकारी अंशांकन मुक्त एकाग्रता विश्लेषण का उपयोग एकाग्रता (CFCA) का निर्धारण और कुल प्रोटीन एकाग्रता के साथ प्राप्त मानों की तुलना के रूप में एक द्वारा निर्धारित<sub280></sub>. उसके बाद, प्रत्येक cystatin बी papain के लिए बाध्य संस्करण के कैनेटीक्स एकल चक्र कैनेटीक्स (SCK) का उपयोग करके मापा जाता है. हम बताते हैं कि एक चार cystatin बी वेरिएंट हम जांच की बाइंडिंग के लिए केवल आंशिक रूप से सक्रिय है. यह आंशिक गतिविधि, CFCA से पता चला है, निरंतर संघ दर में एक महत्वपूर्ण अंतर करने के लिए अनुवाद (<em> कश्मीर</em_एक) और आत्मीयता (<em> कश्मीर</em_डी), कुल प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर की गणना मूल्यों की तुलना में. एक अध्ययन संरचना समारोह में गतिज विश्लेषण के साथ संयोजन में CFCA का उपयोग विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए योगदान देता है, और बातचीत तंत्र की सही व्याख्या करने में मदद करता है.

Protocol

चित्रा 1. Papain साथ cystatin बी (नीला) परिसर (पीला) के तीन आयामी संरचना. उत्परिवर्तित cystatin बी अवशेषों लाल रंग में दिखाया जाता है. 1. लेबल मुक्त इंटरेक्शन Biacore सिस्टम का उपयोग विश्लेषण के सिद्धांतों एक ठेठ मुक्त लेबल बंधन एक Biacore प्रणाली का उपयोग कर प्रयोग में, एक biomolecule करार दिया 'ligand' एक सेंसर चिप की सतह से जुड़ी है. प्रवाह चैनलों की एक प्रणाली चिप सतह है, जहां पता लगाने की जगह लेता है के साथ संपर्क में अपनी बाध्यकारी साथी, 'analyte' करार दिया है, लाता है. जब analyte ligand को बांधता है, सतह पर बड़े पैमाने पर जमते में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन सतह plasmon अनुनाद (SPR) द्वारा पता लगाया है. SPR प्रतिक्रिया बाध्यकारी analyte की राशि के लिए आनुपातिक है. चूंकि बंधन वास्तविक समय में मापा जाता है, गतिज संघ और पृथक्करण एक विशिष्ट बातचीत के लिए दर स्थिरांक निर्धारित किया जा सकता है. इन स्थिरांकों से, यह निरंतर संतुलन पृथक्करण के रूप में आत्मीयता की गणना करने के लिए संभव है. यह भी स्थिर राज्य डेटा बाइंडिंग से आत्मीयता की गणना करने के लिए संभव है. ऐसा ही एक पद्धति का प्रयोग भी करने के लिए एक प्रोटीन की एकाग्रता है कि विशेष रूप से सतह पर एक ligand बांध निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 2. एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की गतिज गुणों का विश्लेषण Biacore X100, गतिज विश्लेषण एकल चक्र कैनेटीक्स का उपयोग किया जा सकता है है. एक एकल चक्र कैनेटीक्स प्रयोग में, analyte के एक एकाग्रता एक विश्लेषण चक्र श्रृंखला में इंजेक्शन के बीच में सतह के उत्थान के बिना इंजेक्शन है. इसलिए, एकल चक्र कैनेटीक्स गतिज विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है जब यह मुश्किल है के लिए उपयुक्त उत्थान की स्थिति खोजने है. एक बार एक काइनेटिक प्रयोग के लिए डाटा एकत्र किया गया है, Biacore X100 मूल्यांकन सॉफ्टवेयर एक बातचीत के मॉडल के लिए डेटा ढाले के द्वारा कश्मीर एक, कश्मीर, घ, और कश्मीर विकास के मूल्यों को उत्पन्न करता है. 3. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण Biomolecules के बीच बातचीत का विश्लेषण उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. अन्य प्रोटीन प्रोटीन के बंधन में निस्र्पक, न्यूक्लिक एसिड या छोटे अणुओं के लिए जैव रासायनिक अनुसंधान करने के लिए मौलिक है, और दवाओं की खोज सहित कई अन्य क्षेत्रों में उपयोग पाता है. दो बातचीत प्रोटीन के बीच बातचीत कैनेटीक्स का सही माप के लिए यह जरूरी है कि analyte के रूप में प्रयोग किया जाता है प्रयोगात्मक नमूना में विशेष रूप से बाध्यकारी प्रोटीन की एकाग्रता पता है. एक 280 या इस तरह के रूप में वर्णमिति assays के एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पढ़ने ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक रोजगार सामान्यतः करने के लिए कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, प्रोटीन दोष के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रोटीन दोनों सक्रिय और निष्क्रिय रूपों कुल प्रोटीन एकाग्रता में शामिल हैं. पुनः संयोजक प्रोटीन, जो निष्क्रिय गलत तह कारण हो सकता है के मामले में विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है कि नमूने में विशेष रूप से बाध्यकारी प्रोटीन का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए. Biacore X100, विशिष्ट बंधनकारी गतिविधि करने के लिए संबंधित एकाग्रता या तो बाध्यकारी प्रतिक्रिया स्तर के एक अंशांकन एक ज्ञात मानक से, या अधिक हाल ही में शुरू की कार्यप्रणाली अंशांकन मुफ्त एकाग्रता विश्लेषण (CFCA) का उपयोग करके प्राप्त वक्र की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. CFCA एक मानक पर भरोसा नहीं करता. इसलिए, CFCA प्रोटीन की उत्परिवर्ती रूपों, जहां मानकों को आम तौर पर उपलब्ध नहीं हैं का अध्ययन करने के मामले में विशेष रूप से उपयोगी है. एक CFCA प्रयोग में, प्रारंभिक बंधन दर शर्तों के तहत विभिन्न प्रवाह दरों पर मापा जाता है जब चिप सतह के नमूने की प्रसार दर सीमित है. analyte के प्रसार गुणांक, प्रवाह सेल और प्रवाह दरों के आयामों को ध्यान में रखा जाता है जब प्रारंभिक बंधन दर 1,2 से विशिष्ट बंधनकारी एकाग्रता की गणना. एक कैनेटीक्स प्रयोग में, analyte की एकाग्रता गतिज संघ दर लगातार और प्रयोगात्मक डेटा से आत्मीयता की गणना में प्रयोग किया जाता है. CFCA और Biacore प्रणालियों में गतिज माप दोनों ही बातचीत के गुणों पर निर्भर है. इसलिए, विशिष्ट बंधनकारी Biacore विश्लेषण द्वारा निर्धारित एकाग्रता, बजाय कुल प्रोटीन एकाग्रता, का उपयोग कर परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ जाती है. 4. Biacore विश्लेषण का उपयोग करने के लिए cystatin बी और papain के बीच बातचीत विशेषताएँ स्तनधारी cystatin बी papain तरह सिस्टीन proteinases, मुख्य रूप से cathepsin बी, एच, कश्मीर, एल और एस के एक पलटवाँ, प्रतिस्पर्धी और तंग बाध्यकारी प्रोटीन अवरोध करनेवाला है ये प्रोटीन nons में मुख्य रूप से शामिल हैंवैकल्पिक intracellular प्रोटीन गिरावट. Cystatins इन एंजाइमों द्वारा अनुचित proteolysis से कोशिकाओं और ऊतकों की रक्षा करने के लिए प्रकल्पित कर रहे हैं. उन्होंने यह भी परजीवी और वायरस से सिस्टीन proteinases निष्क्रिय और जैसे संक्रामक एजेंटों के आक्रमण के खिलाफ बचाव में भाग ले सकते है. इसके अलावा, cystatins papain के रूप में कई संयंत्र सिस्टीन proteinases, जो अक्सर संरचना समारोह अध्ययन में एक मॉडल एंजाइम के रूप में प्रयोग किया जाता है रोकना. papain 3 से पता चलता है कि दो प्रोटीनों के बीच बातचीत हाइड्रोफोबिक संपर्कों, जो अवरोध करनेवाला ओर से एन सी टर्मिनल समाप्त होता है और दो ​​सड़क के ढालवाँ छोरों द्वारा प्रदान की जाती हैं द्वारा प्रभुत्व है के साथ तीन आयामी cystatin बी कॉम्प्लेक्स की संरचना ( चित्रा 1). इस अध्ययन में, हम गोजातीय cystatin का उपयोग करके papain बंधन के लिए सी – टर्मिनल अंत और cystatin बी के दूसरे बाध्यकारी पाश के महत्व की जांच बी papain के साथ बातचीत के क्षेत्रों में बिंदु म्यूटेशन युक्त वेरिएंट. हम पहले चार cystatin बी इस्तेमाल किया वेरिएंट की विशिष्ट बंधनकारी, एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार के प्रोटीन की निर्धारित करते हैं. एक बार सक्रिय cystatin बी के विशिष्ट बंधनकारी सांद्रता निर्धारित कर रहे हैं, जंगली प्रकार और papain के लिए बाध्य cystatin बी के उत्परिवर्ती वेरिएंट की दर और आत्मीयता स्थिरांक Biacore X100 का उपयोग कर मापा जाता है. 5. साधन और अभिकर्मकों cystatin बी वेरिएंट Cys3Ser/His75Gly Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala और Cys3Ser के रूप में 4 वर्णित पहले उत्पादित कर रहे हैं. सभी म्यूटेंट सिस्टीन की एक अतिरिक्त 3 स्थान पर सेरीन के लिए प्रतिस्थापन होते हैं, cystatin बी के डाइसल्फ़ाइड से जुड़े निष्क्रिय dimers के गठन को रोकने के papain लक्ष्य भी रूप में पहले 5 में वर्णित तैयार है. यह एस (methylthio) papain (MMTS papain) एक methylthio समूह सक्रिय फांक में Cys25 से जुड़ी, protease प्रतिपादन catalytically निष्क्रिय होने Biacore X100 प्लस पैकेज के साथ Biacore X100 को मापने के लिए और विशिष्ट बंधनकारी सांद्रता और बाध्यकारी कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. MMTS papain सेंसर चिप Biacore अमाइन युग्मन किट का उपयोग कर CM5 पर स्थिर है. रन 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं, और बफर 0.01 7.4 पीएच में एम Hepes, 0.15 एम NaCl, ०.००३४ एम EDTA, और 0.05% 20 polysorbate. Cystatin बी के प्रत्येक संस्करण के बीच 20 मिमी NaOH के साथ, संवेदक सतह में 10 μl / मिनट के एक प्रवाह दर पर 30 सेकंड के लिए पुनर्जीवित है. Ligand MMTS – papain के 6.Immobilization CFCA विश्लेषण के लिए MMTS papain के सहसंयोजक अनुलग्नक CFCA शर्तों के तहत जहां दर analyte अणुओं की सतह के लिए प्रसार (जन परिवहन सीमा) के द्वारा सीमित है बाध्यकारी दर के माप पर निर्भर करता है. इस ligand के उच्च स्थिरीकरण स्तर द्वारा अनुग्रह प्राप्त है. MMTS – papain का स्थिरीकरण स्थापित किया गया था और Biacore X100 नियंत्रण सॉफ्टवेयर का स्थिरीकरण विज़ार्ड का उपयोग कर चला. प्रवाह कक्ष में 2 में 10 μl / मिनट के एक प्रवाह दर पर 7 मिनट के लिए (एनएचएस) succinimide और carbodiimide (EDC) के एक मिश्रण के इंजेक्शन से सतह को सक्रिय करें. फ्लो एक सेल छोड़ा है असंशोधित क्रम में एक संदर्भ सतह के रूप में इस्तेमाल किया जा. 50μg/ml में पीएच 4.5 में 5 μl / मिनट के एक प्रवाह दर पर 15 मिनट के लिए सोडियम एसीटेट बफर में MMTS papain इंजेक्षन. Ethanolamine 7 मिनट के लिए 10 μl / शेष सक्रिय एस्टर निष्क्रिय मिनट की एक प्रवाह दर पर इंजेक्शन है. पूरे युग्मन प्रक्रिया में परिणाम चाहिए ~ 3000 MMTS papain RU प्रवाह कक्ष 2 में immobilized. काइनेटिक विश्लेषण के लिए MMTS papain के सहसंयोजक अनुलग्नक उसी प्रक्रिया गतिज विश्लेषण के लिए MMTS papain फर्क सिर्फ इतना किया जा रहा है कि गतिज विश्लेषण में, स्थिरीकरण स्तर कम हो क्रम में प्रसार द्वारा सीमित बनने के लिए बाध्य दर से बचने की जरूरत के साथ, immobilizing के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्लो एक कक्ष छोड़ दिया है इस चरण में असंशोधित रूप में अच्छी तरह से क्रम में एक संदर्भ सतह के रूप में इस्तेमाल किया जा. एन एच एस और 7.1 के रूप में EDC के मिश्रण के साथ सतह के सक्रियण के बाद, MMTS papain 1μg/ml पर 50 सेकंड के लिए अंतःक्षिप्त है. उसके बाद सतह के रूप में 7.3 चरण में ethanolamine का एक इंजेक्शन के साथ सक्रिय है. युग्मन स्तर लगभग 50 RU इस प्रक्रिया के बाद किया जाना चाहिए. 7. निर्धारण cystatin बी CFCA परख का उपयोग एकाग्रता CFCA प्रयोग Biacore X100 प्लस पैकेज में CFCA विज़ार्ड के अनुसार सेट कर दिया जाता है. लगभग 10 एनएम प्रोटीन प्रवाह 10 और 100 / μl दो प्रतियों में 48 सेकंड के लिए मिनट की दर पर इंजेक्शन है. सतह के प्रत्येक चक्र के बीच 20 मिमी NaOH के साथ पुनर्जीवित है. प्रत्येक प्रवाह की दर के लिए रिक्त इंजेक्शन शामिल है. प्रोटीन एकाग्रता तो बाध्यकारी (चित्रा 3) डेटा वें का उपयोग से निर्धारित किया जाता हैBiacore X100 प्लस पैकेज मूल्यांकन सॉफ्टवेयर के ई CFCA मूल्यांकन सुविधा. चित्रा 2 CFCA जंगली प्रकार cystatin बी विशिष्ट बंधनकारी एकाग्रता डेटा के विश्लेषण से परिणाम 10 और 100 / μl मिनट के प्रवाह दरों पर प्राप्त sensorgrams से निकाला गया था. म्यूटेंट के Figure 3. सांद्रता एक 280 (n = 3) माप और CFCA (n = 2) का उपयोग निर्धारित की . मानक त्रुटियों त्रुटि सलाखों से चिह्नित हैं. दाढ़ अवशोषण गुणांक की गणना के रूप में (6) में वर्णित थे. Cys3Ser/Leu73Gly उत्परिवर्ती की एकाग्रता दो विधियों द्वारा निर्धारित मूल्यों में एक बड़ा अंतर देखा जा सकता है. जब एकाग्रता CFCA द्वारा उस के साथ एक 280 माप द्वारा निर्धारित की तुलना में, यह स्पष्ट है कि, जबकि ज्यादातर मामलों में प्रोटीन Cys3Ser/Leu73Gly संस्करण के लिए पूरी तरह से सक्रिय है, सक्रिय प्रोटीन का अंश बहुत कम है (चित्रा 3). नीचे दी गई तालिका cystatin बी 280 ए द्वारा कुल सांद्रता से संबंधित वेरिएंट की गतिविधियों से पता चलता है. नमूना 280 ए (%) के संबंध में CFCA जंगली प्रकार 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83 8. Papain बाध्यकारी cystatin बी के कैनेटीक्स मापना CFCA माप के आधार पर, एक एकाग्रता दो गुना श्रृंखला 2.5 से cystatin बी वेरिएंट के प्रत्येक के लिए 40 एनएम लेकर तैयार करते हैं. कैनेटीक्स प्रयोग स्थापित Biacore X100 में एकल चक्र दृष्टिकोण के साथ कैनेटीक्स विज़ार्ड का उपयोग. सतह पुनर्जीवित इंजेक्शन के बीच नहीं है, लेकिन विश्लेषण प्रत्येक चक्र के अंत के बाद पुनर्जनन समाधान के रूप में 20 मिमी NaOH उपयोग कर. प्रयोग इतना है कि प्रत्येक चक्र युक्त नमूना एक खाली चक्र है, जहां बफर नमूने के बजाय इंजेक्शन है द्वारा flanked है सेट. Biacore X100 में कैनेटीक्स मूल्यांकन सुविधा का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से संदर्भ के रिक्त subtractions प्रदर्शन एक 1:1 बातचीत मॉडल फिटिंग से पहले डेटा घटाया. प्रयोगात्मक डेटा cystatin बी वेरिएंट के लिए बाध्य papain प्राप्त चित्रा 4 में दिखाया गया है. नीचे दी गई तालिका संघ और पृथक्करण दर स्थिरांक और संतुलन हदबंदी काइनेटिक विश्लेषण में प्राप्त स्थिरांक सार. नमूना कश्मीर एक (-1 एम एस -1) कश्मीर घ (-1 एस) कश्मीर विकास (एम) जंगली प्रकार 1.8 10 x 6 0.41 x 10 -3 2.3 10 -10 एक्स Cys3Ser/His75Gly 1.1 10 x 6 1.7 x 10 -3 1.5 -9 10 एक्स Cys3Ser/Leu73Gly 1.1 10 x 6 23 x 10 -3 2.2 10 -8 एक्स Cys3Ser/Tyr97Ala 1.7 x 10 6 12 x 10 -3 7.1 x 10 -9 Cys3Ser 0.9 10 x 6 0.53 x 10 -3 5.8 10 -10 एक्स चित्रा 4 cystatin बी MMTS – papain के लिए बाध्य वेरिएंट के लिए काइनेटिक प्रोफाइल एकल चक्र कैनेटीक्स का उपयोग करके निर्धारित है . Sensorgrams रिक्त दिखाने और संदर्भ गतिज फिट के साथ 01:01 बातचीत काले रंग में मढ़ा मॉडल के लिए डेटा घटाया. जबकि म्यूटेंट के सहयोग दर जंगली प्रकार प्रोटीन (5 चित्रा, ऊपरी पैनल) के बराबर हैं, म्यूटेंट के पृथक्करण दर स्थिरांक परिमाण के आदेश के करीब दो द्वारा उच्च संतुलन हदबंदी में एक इसी वृद्धि के साथ किया जा सकता है निरंतर (5 चित्रा, कम पैनल). चित्रा 5] दर और आत्मीयता स्थिरांक की गणना CFCA से प्राप्त सांद्रता पर आधारित थे. कश्मीर एक, कश्मीर घ और कश्मीर विकास, परिवर्तन के साथ जुड़े परिवर्तन के रेखांकन में चित्रित कर रहे हैं . चूंकि नमूना एकाग्रता संघ प्रयोगात्मक डेटा से स्थिर दर की गणना में एक पैरामीटर है, यह हैमहत्वपूर्ण है कि यह सही है. एक CFCA के बजाय 280 माप के आधार पर एकाग्रता का उपयोग निष्कर्ष पर नेतृत्व है कि Leu73 संघ दर, जहां प्रतिस्थापन के बारे में 10 बार अन्य cystatin बी वेरिएंट की तुलना में धीमी संघ में परिणाम लगता है के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, विशिष्ट बंधनकारी CFCA द्वारा मापा एकाग्रता इस मामले में कुल प्रोटीन के बारे में केवल 10% है. जब यह खाते में इस ले लिया है यह स्पष्ट हो जाता है कि संघ दर Leu73 लिए अन्य वेरिएंट के समान है. इसलिए, CFCA कश्मीर एक और कश्मीर विकास का सही आकलन इस प्रकार बातचीत तंत्र की उचित व्याख्या संभव बनाने के लिए अनुमति देता है.

Discussion

इस काम में, चार म्यूटेंट और जंगली प्रकार cystatin बी का उत्पादन क्रम में बाध्यकारी दूसरे लूप के महत्व का आकलन करने के लिए और सी – टर्मिनल cystatin बी और papain के बीच बातचीत के लिए समाप्त हो जाती है. इस अध्ययन से लाभ और Biacore X100 का उपयोग करने के लिए विशिष्ट बंधनकारी एकाग्रता का निर्धारण और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के कैनेटीक्स का विश्लेषण क्रम में संरचना समारोह रिश्तों को समझने में आसानी प्रदर्शन किया. हम पता चला है कि कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने प्रोटीन वेरिएंट कि बाध्यकारी गतिविधि है, जो इस मामले में बंधन आत्मीयता और कैनेटीक्स के निर्धारण में एक महत्वपूर्ण माप त्रुटि परिचय कम कर दिया है प्रकट नहीं करता है. cystatin बी वेरिएंट की विशिष्ट बंधनकारी सांद्रता Biacore X100 के साथ CFCA का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. CFCA द्वारा गतिज विश्लेषण करने के लिए इनपुट के रूप में एकाग्रता माप का उपयोग विश्वसनीय दर और आत्मीयता स्थिरांक में परिणामस्वरूप, इस प्रकार बातचीत तंत्र की सही व्याख्या की अनुमति है.

म्यूटेंट की कमी आई समानताएं लगभग विशेष रूप से एक बढ़ा कश्मीर _घ मूल्य की वजह से थे, जबकि कश्मीर केवल थोड़ा प्रभावित था. यह व्यवहार इंगित करता है कि दोनों दूसरा बंधन पाश क्षेत्र और सी – टर्मिनल अंत papain अवरोध करनेवाला के बंधन दर के लिए महत्वपूर्ण नहीं हैं. इसके बजाय, वे रखते हुए अवरोध करनेवाला एंजाइम से जुड़ी एक बार जटिल गठन किया गया है द्वारा मुख्य रूप से बाध्यकारी आत्मीयता के लिए योगदान करते हैं.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Biacore™ X100 System		GE Healthcare	BR-1100-73	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Biacore™ X100 Plus Package		GE Healthcare	BR-1007-98	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Sensor Chip CM5		GE Healthcare	BR-1000-14	http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html
Amine Coupling Kit		GE Healthcare	BR-1000-50
Acetate buffer pH 4.5, 50 ml		GE Healthcare	BR-1003-50
HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml		GE Healthcare	BR-1008-26
Plastic Vials Ø 11 mm		GE Healthcare	BR-1002-87
Rubber caps, type 2		GE Healthcare	BR-1004-11