Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones
Summary
Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.
Abstract
El ser humano gastrointestinal (GI) es un entorno único en el que las células epiteliales intestinales y no patógenas (comensales), las bacterias conviven. Se ha propuesto que el microambiente que el patógeno se encuentra en la capa de comensales es importante para determinar la extensión de la colonización. Los métodos actuales de cultivo para la investigación de la colonización de patógenos no son muy adecuadas para la investigación de esta hipótesis, ya que no permiten el co-cultivo de bacterias y células epiteliales de una forma que imita el microambiente del tracto gastrointestinal. Aquí se describe un co-cultivo de microfluidos modelo que permite a la cultura independiente de las células eucariotas y las bacterias, y probar el efecto del microambiente comensales en la colonización de patógenos. El modelo de co-cultivo se demuestra mediante el desarrollo de un comensal<em> Escherichia coli</em> Biofilm entre las células HeLa, seguido por la introducción de enterohemorrágica<em> E. coli</em> (EHEC) en la isla de comensales, en una secuencia que reproduce la secuencia de eventos en infección del tracto GI.
Protocol
Discussion
Ensayos convencionales para la fijación y la colonización de patógenos utilizar una monocapa de células eucariotas en placas de cultivo de tejido en el que los agentes patógenos se agregan. Estos modelos no son fisiológicamente relevantes, ya que no incorporan un biofilm de bacterias comensales desarrollado en las células eucariotas. Simple adición de un cultivo de bacterias pre-convertido en células eucariotas es improbable que lleve a esta conformación, como los biofilms son muy organizadas las estructuras q…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0846453) y los Institutos Nacionales de Salud (1R01GM089999).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | Microchem Corp, MA | |||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | |||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | ||
| PDMS | Dow Corning, WI | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | ||
| DMEM | Thermo Scientific | SH30002.02 | ||
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | ||
| Mask aligner | Neutronix-Quintel, PA | Q4000 | ||
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA | |||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
Referências
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
