دراسة تجمعات الحويصلة متشابك من الأصباغ باستخدام Photoconversion Styryl
Summary
وقد الأصباغ وزير الخارجية للمساعدة لا تقدر بثمن في فهم ديناميات متشابك. ويتبع عادة وزراء خارجية تحت المجهر الفلورسنت خلال ظروف مختلفة التحفيز. ومع ذلك ، photoconversion من الأصباغ وزير الخارجية جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني يسمح التصور من حمامات متميزة حويصلة متشابك ، الترآيب الدقيق بين مكونات أخرى ، وحبات متشابك.
Abstract
اندماج الحويصلات متشابك مع غشاء البلازما (إيماس) هو خطوة لازمة في الافراج عن العصبي والاتصالات العصبية. ثم يتم استرداد الحويصلات من غشاء البلازما (الإلتقام) ويتم تجميعها معا مع التجمع العام للحويصلات داخل محطة العصبية ، حتى الخضوع لEXO ودورة جديدة الإلتقام (تدوير الحويصلة). وقد درست هذه العمليات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات مثل المجهر الإلكتروني والتسجيلات الكهربية وamperometry وقياسات السعة. الأهم من ذلك ، خلال العقدين الماضيين ظهر عدد من علامات fluorescently المسمى ، والسماح لتتبع تقنيات بصرية الحويصلات في الديناميات الخاصة بإعادة التدوير. واحدة من العلامات الأكثر شيوعا هي styryl FM أو صبغة 1 ؛ هيكليا ، وكلها تحتوي على الأصباغ وزير الخارجية رئيس ماء وذيل محبة للدهون متصلا من خلال حلقة العطرية واحد أو أكثر من السندات المزدوجة (الشكل 1B). وصبغ التجربة الكلاسيكية وزير الخارجية لتسمية مجموعة من الحويصلات تتمثل في إعداد الاستحمام (الشكل 1Ai) مع الصبغة خلال تحفيز العصب (كهربائيا أو مع ارتفاع K +). هذا يؤدي الى إعادة تدوير حويصلة وتحميل اللاحقة للصباغة في الحويصلات endocytosed مؤخرا (الشكل 1A I – III). وبعد تحميل الحويصلات مع صباغة ، جولة ثانية من التحفيز في حمام صبغة خالية تؤدي الى الافراج عن وزير الخارجية خلال إيماس (الشكل 1A IV – V) ، والعملية التي يمكن اتباعها من خلال رصد انخفاض كثافة مضان (destaining).
على الرغم من الأصباغ وزير الخارجية قد ساهمت إلى حد كبير في مجال إعادة التدوير الحويصلة ، فإنه ليس من الممكن تحديد الدقيق أو توطين مورفولوجية حويصلات الفردية باستخدام المجهر مضان التقليدية. لهذا السبب ، نحن هنا شرح كيفية FM الأصباغ ويمكن أيضا أن تستخدم كعلامات التقامي باستخدام المجهر الإلكتروني ، من خلال photoconversion. تقنية photoconversion يستغل ممتلكات الأصباغ الفلورية لتوليد أنواع الاكسجين التفاعلية تحت الإضاءة الشديدة. وغرقت الاستعدادات fluorescently المسمى في محلول يحتوي على diaminobenzidine (DAB) ومضيئة. رد الفعل الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات صبغة أكسدة DAB ، الذي يشكل مستقرة ، غير قابلة للذوبان تترسب يحتوي على المظهر المظلم الذي يبدو ويمكن تمييزها بسهولة في المجهر الإلكترون 2،3. كما يتأكسد DAB فقط في الجوار المباشر للجزيئات فلوري (كما في أنواع الاكسجين التفاعلية قصيرة الأجل) ، وتقنية تضمن هياكل fluorescently فقط المسمى ذاهبون لاحتواء يعجل الإلكترونات كثيفة. هذه التقنية تسمح بذلك دراسة مورفولوجية والمكان المحدد لإعادة تدوير بنشاط العضيات.
Protocol
Discussion
وينبغي اتخاذ بعض الخطوات الهامة في الاعتبار :
- ينبغي أن يقوم على حضانة DAB إلا بعد الغسل الكامل والتبريد من الاستعدادات. وإلا فإن رد فعل غير غلوتارالدهيد التفاعل مع وتسبب هطول الأمطار DAB والخمسين (عادة على شكل بلورات ال?…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
Referências
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
