Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie
Summary
Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken van<em> In ovo</em> Elektroporatie van de reportergenen onder de controle van specifieke enhancer elementen.
Abstract
Tewerkstelling van enhancer elementen om de expressie van reportergenen rijden in neuronen is een veel gebruikt model voor het bijhouden van axonale projectie. Voor het volgen van axonale projectie van spinale interneuronen in gewervelde dieren, kiemlijn gerichte reportergenen opbrengst bilateraal symmetrisch etikettering. Daarom is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de ipsi-en contra-lateraal uitstekende axonen. Eenzijdige elektroporatie in het kuiken neurale buis is een nuttig middel om de expressie van een reportergen te beperken tot een kant van het centrale zenuwstelsel, en om axonale projectie te volgen aan beide zijden<sup> 1 ,2-5</sup>. Deze video toont eerste hoe om te gaan de eieren voorafgaand aan de injectie. Bij HH stadium 18-20, DNA wordt geïnjecteerd in de sacrale niveau van de neurale buis, dan wolfraamelektroden zijn parallel geplaatst om het embryo en korte elektrische pulsen worden toegediend met een pulsgenerator. Het ei is afgedicht met tape en teruggeplaatst in een incubator voor verdere ontwikkeling. Drie dagen later (E6) het ruggenmerg wordt verwijderd als een open boek voorbereiding van embryo's, vaste en verwerkt voor de ganse berg antilichaam kleuring. De gebrandschilderde ruggenmerg is gemonteerd op dia en gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.
Protocol
Discussion
Elektroporatie van plasmide DNA in het kippenembryo ontwikkelt zich als een krachtige techniek voor in vivo ectopische expressie. De combinatie van specifieke enhancers, en chick elektroporatie biedt een snelle en efficiënte tool voor het ontcijferen van axonale paden van een genetisch bepaalde groep neuronen 1,3,5. Gebruik makend van de Cre / loxP en de Gal4/UAS versterking systemen kunnen vergroten het niveau en de duur van meningsuiting. De opkomende beeld is van een complex divergentie van axonale signal…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AK van de Israel Science Foundation, het Israëlische Ministerie van gezondheid, en DFG (de Duitse Research Foundation).
Referências
- Zisman, S., et al. Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule. J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).
- Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate. Brain Res. 1223, 25-33 (2008).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4 (1), 21 (2009).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).
- Reeber, S. L., et al. Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord. J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).
