Mama is een uniek Magnetosome geassocieerd eiwit dat werd aangetoond dat het betrokken is bij magnetosome activering. Hier presenteren we de zuivering protocol van Mama deletiemutant (MamAΔ41) van<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Magnetotactic bacteriën vormen een diverse groep van aquatische micro-organismen die in staat zijn om zich te oriënteren langs geomagnetische velden. Dit gedrag wordt verondersteld om hun zoektocht naar geschikte omgevingen hulp<em> (1)</em>. Deze mogelijkheid is verleend door de magnetosome, een subcellulaire organel dat bestaat uit een lineaire keten assemblage van lipide vesicles elke staat zijn om biomineralize en omsluiten een ~ 50-nm kristal van magnetiet hetzij greigite. Een principe onderdeel van de magnetosome dat was aangetoond dat nodig voor de vorming van functionele blaasjes is Mama. Mama is een zeer overvloedige magnetosome-geassocieerd eiwit dat is een van de meest gekenmerkt magnetosome-geassocieerde eiwitten<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Dit artikel richt zich op de zuivering van Mama, die ondanks het feit dat onderzocht<em> In vivo</em>, Hebben geen duidelijke functionele of structurele details geïdentificeerd voor. Bio-informatica analyse suggereerde dat Mama is een tetra-tricopeptide herhalen (TPR) met eiwit. TPR is een structureel motief gevonden als zodanig of die deel uitmaken van een groter vouw in een breed scala van eiwitten, het dient als een sjabloon voor eiwit-eiwit interacties en bemiddelt multi-eiwit-complexen<em> (7)</em>. TPRs zijn betrokken bij vele cruciale taken in eukaryote cel organel processen en vele bacteriële paden<em> (8-14).</em> Om te begrijpen Mama, een unieke TPR eiwit bevat, is sterk gezuiverde eiwit nodig zijn als een eerste stap. In dit artikel presenteren we de zuivering protocol voor een stabiele Mama deletiemutant (MamAΔ41) van<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Eiwitzuivering is de belangrijkste stap in elk eiwitten biochemische of structurele studies. Omdat elk eiwit is uniek met zijn eigen gedrag, moet men de eigenschappen bepalen en dienovereenkomstig aan te passen zijn zuivering. Eiwit doel moet worden geanalyseerd als een eerste stap in de richting van zuivering met behulp van bioinformatica tools. Ze worden gebruikt om het doel iso-elektrisch punt te berekenen, zijn nodig voor het verminderen / oxiderende omgeving en de behoefte aan speciale ionen / liganden te beoordele…
Wij erkennen Dr Amir Aharoni voor zijn steun en Geula Davidov, Noam Grimberg en Chen Guttman voor hun adviezen en opmerkingen.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |