Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC
Summary
Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.
Abstract
MSC son una población de células madre adultas, que es una fuente prometedora para aplicaciones terapéuticas. Estas células pueden ser aisladas de la médula ósea y pueden separarse fácilmente de las células madre hematopoyéticas (HSC), debido a su adhesión de plástico. Este protocolo describe cómo aislar las MSC del fémur y la tibia de ratas. Las células aisladas se enriquecieron aún más en contra de dos marcadores de superficie CD54 y CD90 MSC por la clasificación de células magnéticas. Expresión de marcadores de superficie CD54 y CD90 fueron luego confirmadas por análisis de citometría de flujo. HSC marcador CD45 también se incluyó para comprobar si los ordenados MSC se agotaron las CMH. MSC son, naturalmente, muy heterogéneos. Hay subpoblaciones de células que tienen diferentes formas, la proliferación y diferenciación de las capacidades. Estas subpoblaciones todos expresan el conocido marcadores de CMM y ningún marcador único ha sido identificado por las distintas subpoblaciones. Por lo tanto, un enfoque alternativo para separar las distintas subpoblaciones está utilizando cilindros de clonación para separar de una sola colonia de células derivadas. Las células derivadas de las colonias solo se puede cultivar y evaluar por separado.
Protocol
Discussion
Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer MSC. Un método para separar las células de una sola colonia de derivados también se ha incorporado. Hay varios pasos que son importantes para una separación exitosa de aislamiento, el enriquecimiento y la colonia. Mientras se hace el aislamiento de células de rata, se recomienda filtrar con un colador celular o una malla de nylon estéril de tamaño similar para deshacerse de los coágulos de sangre y restos óseos. Después de la siembra de las células durante la …
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud (R01GM079688, R21RR024439 y R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055), y la Fundación MSU.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
Referências
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