胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する
Summary
このアッセイは、交連軸索の向きを変更、シグナル伝達分子、ここに骨形成タンパク質7（BMP7）の能力を評価する。胚の背側脊髄の外植片は、COS細胞の分泌候補増殖因子の集合体に隣接して培養する。外植片の中で成長しているReoriented交連軸索は、免疫組織化学により可視化。
Abstract
脊椎動物の脊髄1の背側交連軸索は軸索ガイダンスシグナルを識別するための貴重なモデルシステムとなっている。ここで、我々は、in vitroアッセイ、交連軸索の方向2に外因性と内因性シグナルの効果を研究するために広く用いられている"方向転換アッセイ"、 で説明します。このアッセイは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で多数の人々によって開発されました（詳細については、確認応答を参照）、このアッセイのバージョンがでchemorepellent BMPを含む、主要な軸索ガイダンス分子の再配向の活動を示すために使用された屋根板3,4と脊髄での床の板でNetrin1 5とソニックヘッジホッグ（Shh）6 chemoattractive活動。
脊髄の背側三分の二の2-3のセグメントを構成する外植片は、胎生（E）11ラットから切除し、三次元コラーゲンゲル7で培養される。 E11背側脊髄外植片は、糖タンパク質、Tag1に8の彼らの軸索の表現によって識別することができる新たに生まれた交連ニューロンが含まれています。文化30〜40時間かけて、交連軸索の軌跡は、 生体内で見られるのと同様のタイムコースでこれらの背側外植片にrecapitulatedている。この軸索軌道は、テストの組織または背側外植片の側縁の一つと接触して候補シグナル伝達分子を発現するCOS細胞の集合のどちらかを置くことによって挑戦することができます。追加された組織の近傍に延在する交連軸索は、内因性の屋根板と異所性の側面組織からの信号の両方の影響を受けて成長します。交連軸索は、これらの状況下でreorientedされる程度を定量化することができる。このアッセイを使用して、それは両方が交連軸索3,4と同様交連軌道9を指示するためにこの信号のための必要性を新しい方向に向けるために特定の信号の十分性を調べることが可能です。
Protocol
Discussion
このアッセイを行うに成功したかどうかを判断する重要な要因が最初に、組織があまりにも長時間ディスパーゼで処理されるべきではないされ、そのような治療は、組織が非常に粘着性と生存率の減少となることになります。二、コラーゲンは完全にプライムし、可能な限り氷上で保存する必要があります。それが設定を開始する場合は、処理することはますます困難になる、ピンクターン?…
Acknowledgements
このプロトコルは、ジェーンドッド、トーマスJessellとアンドリューラムズデンの研究室で開発されました。コンラートバスラー、アンCalof、トーマスエドランド、フィルハミルトン、Domna Karagogeos、アリエルルイス私Altabaと俊哉山田を含む多くの人々は、どのようにコラーゲンの脊髄の文化の外植片に決定。 Marysia Placzekとマルクテッシェ-ラヴィーンは、軸索ガイダンスの分子を識別する手段として、生体外植片からで軸索の成長を使用してのテクニックを開拓してきました。バトラーの実験室での作業は、NIH / NINDSからダイムの月とR01 NS063999からの補助金によってサポートされています。
Referências
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
