يعاير قدرة إنتشاري جزيئات إشارة إلى إعادة توجيه الجنينية محاور عصبية صواري العمود الفقري
Summary
هذا الاختبار يقيم قدرة جزيء الإشارة ، هنا تخلقية بروتين العظام 7 (BMP7) ، إلى إعادة توجيه محاور صواري. هو مثقف لازدراع من الحبل الشوكي الجنينية الظهرية المتاخمة لمجموع إفراز الخلايا COS عوامل النمو مرشح. المحاوير صواري توجيه المتزايد داخل يزدرع هي التي تصور المناعية.
Abstract
وقد المحاوير صواري الظهري في النخاع الشوكي الفقاريات 1 نظام النموذج الذي لا يقدر بثمن في توجيه اشارات لتحديد محور عصبي. هنا ، نحن تصف في الفحص المختبري "، ومقايسة إعادة توجيه" ، التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة تأثير خارجي من الإشارات والجوهرية في اتجاه المحاور صواري 2. وقد تم تطوير هذا الاختبار من قبل عدد كبير من الناس في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو (انظر الاعترافات لمزيد من التفاصيل) وكانت تستخدم الإصدارات من هذا الاختبار للتدليل على أنشطة إعادة توجيه جزيئات مفتاح التوجيه محور عصبي ، بما في ذلك BMP في chemorepellent صفيحة سقف 3،4 والأنشطة chemoattractive من Netrin1 5 و القنفذ الصوتي (SHH) 6 في لوحة الكلمة في الحبل الشوكي.
وتضم تشريح Explants 2-3 شرائح من ثلثي الظهرية للنخاع من يوم الجنينية (E) 11 الفئران والمثقفين في ثلاثة المواد الهلامية الكولاجين الأبعاد 7. explants E11 العمود الفقري الظهري يحتوي على الخلايا العصبية صواري المولود حديثا ، والتي يمكن تحديدها من خلال التعبير عنها محواري من بروتين سكري ، Tag1 8. على مدار ساعات 30-40 في الثقافة ، ولخص مسار محوار صواري في هذه explants الظهرية مع دوام شبيهة بتلك التي شوهدت في الجسم الحي. يمكن الطعن في هذا المسار من خلال وضع محواري الأنسجة إما اختبار أو التجميعية الخلية COS معربا عن جزيء مرشح يشير في اتصال مع واحدة من الحواف الجانبية للازدراع الظهرية. وسوف تمتد صواري المحاور في المنطقة المجاورة للأنسجة إلحاق تنمو تحت تأثير كل من لوحة السقف الذاتية وإشارات من الأنسجة الجانبي خارج الرحم. ويمكن قياس درجة التي يتم توجيه المحاوير صواري في ظل هذه الظروف. باستخدام هذا الاختبار ، فمن الممكن على حد سواء لفحص مدى كفاية إشارة خاصة إلى إعادة توجيه محاور صواري 3،4 فضلا عن ضرورة هذا إشارة لتوجيه مسار صواري 9.
Protocol
Discussion
العوامل الحاسمة التي تحدد النجاح في أداء هذا الاختبار هي أولا ، لا ينبغي أن تعامل مع الأنسجة dispase لفترة طويلة جدا ، وسوف ينتج مثل هذه المعاملة في النسيج تصبح لزجة جدا وبعد أن انخفضت قدرتها على البقاء. اثنين ، يجب أن تكون الكولاجين تستعد تماما ويحرص على الجليد قدر الإمك…
Acknowledgements
وقد تم تطوير هذا البروتوكول في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو. قرر العديد من الناس ، بما في ذلك باسلر كونراد ، Calof آن ، Edlund توماس هاملتون فيل ، Karagogeos دومنا ، ارييل رويز Altaba ط ويامادا Toshiya كيفية explants ثقافة النخاع الشوكي في الكولاجين. رائدة Marysia Placzek ومارك لافين تيسييه – باستخدام تقنية النمو في محور عصبي من explants المختبر كوسيلة لتحديد الجزيئات التوجيه محور عصبي. ويدعم العمل في المختبر بتلر من المنح المقدمة من مارس من الدايمات وNS063999 R01 من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS.
Referências
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
