Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural
Summary
Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.
Abstract
Dorsal axônios comissurais na medula espinhal dos vertebrados 1 ter sido um modelo de sistema de valor inestimável em que identificar sinais de orientação axônio. Aqui, descrevemos um ensaio de vitro ", a reorientação do ensaio", que tem sido amplamente utilizado para estudar o efeito dos sinais extrínsecos e intrínsecos na orientação dos axônios comissurais 2. Este ensaio foi desenvolvido por várias pessoas nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew (ver agradecimentos para mais detalhes) e versões deste ensaio foram usadas para demonstrar as atividades reorientação de orientação das moléculas-chave axônio, incluindo o BMP chemorepellent na chapa de teto 3,4 e as atividades de quimioatratante Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 na placa de fundo na medula espinhal.
Explantes compreendendo 2-3 segmentos da dorsal de dois terços da medula espinhal são dissecados a partir de dia embrionário (E) 11 ratos e cultivadas em três géis de colágeno dimensional 7. E11 dorsal explantes espinhal contém recém-nascido neurônios comissurais, que podem ser identificadas pela sua expressão axonal da glicoproteína, Tag1 8. Ao longo de 30-40 horas em cultura, a trajetória dos axônios comissurais está resumida nestas explantes dorsal com um curso de tempo similar ao observado in vivo. Essa trajetória axonal pode ser contestada, colocando tecidos ou de teste ou um agregado de células COS expressando uma molécula de sinalização candidato em contato com uma das bordas laterais do explante dorsal. Axônios comissurais estendendo na vizinhança do tecido anexado vai crescer sob a influência de ambas as placas do telhado do endógenos e sinais do tecido ectópico lateral. O grau em que os axônios comissurais são reorientadas sob essas circunstâncias podem ser quantificados. Com este ensaio, é possível tanto para examinar a suficiência de um sinal especial para reorientar axônios comissurais 3,4, assim a necessidade de este sinal para direcionar a trajetória comissural 9.
Protocol
Discussion
Os fatores críticos que determinam o sucesso na realização deste ensaio são, primeiro, o tecido não devem ser tratados com dispase por muito prolongado período, este tratamento irá resultar no tecido tornando-se muito pegajoso e ter uma redução da viabilidade. Dois, o colágeno devem estar perfeitamente preparados e mantidos em gelo, tanto quanto possível. Vai tornar-se cada vez mais difícil lidar com se começa a definir, ou seja, passam a rosa. Três, a agulha de tungstênio devem ser mantidos sempre muito …
Acknowledgements
Este protocolo foi desenvolvido nos laboratórios da Jane Dodd, Thomas Jessell e Lumsden Andrew. Muitas pessoas, incluindo Konrad Basler, Calof Ann, Edlund Thomas, Hamilton Phil, Karagogeos Domna, Ruiz Ariel i Altaba e Yamada Toshiya determinada como explantes cultura da medula espinhal em colágeno. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne foi pioneiro na técnica de utilização de crescimento do axônio em explantes in vitro como forma de identificar moléculas de orientação axônio. Trabalho no laboratório Butler é suportado por concessões do March of Dimes e R01 NS063999 de NIH / NINDS.
Referências
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