不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー
Summary
細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス – （スクシンイミジルプロピオネート）]安定一過性と不安定な相互作用<em> in vivoで</em厳格なタンパク質複合体精製技術を用いてそれらの分離を可能にする>、。ここでは、免疫沈降によるタンパク質複合体の分離に続いて培養で増殖架橋のセルのテクニックを紹介。
Abstract
携帯電話機械の動的な性質は、しばしば一過性および/または弱いタンパク質の関連付けに基づいて構築されています。これらの低親和性相互作用は、目的のタンパク質の周りにタンパク質ネットワークの分離と同定のための厳格な方法を排除する。化学架橋剤の使用は、精製のために生化学的な制限をバイパスして、不安定な相互作用の選択的安定化することができます。ここで私たちは12 Å、ジチオビス – （proprionateスクシンイミジル）（DSP）のスペーサーアームでホモ二官能性架橋剤を使用して培養中の細胞のための従順プロトコルを提示する。 DSPは、分子中に存在するジスルフィド結合の還元によって切断される。磁気ビーズによる目的タンパク質のイムノアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせた架橋は、特に精製に耐えられないというタンパク質複合体の分離が可能になります。このプロトコルは、通常のウェスタンブロットの技法と互換性があり、それは質量分析法1によってタンパク質の同定のためにスケールアップすることができます。
ステファニーA. ZlaticとパールV.ライダーは、この作品にも同様に貢献した。
Protocol
Discussion
DSPは、12Åのスペーサーアームを持つ膜透過性、化学的に還元性架橋剤は、一時的なタンパク質相互作用1,2,3,4を安定させるために使用されます。ここでは、アダプタ複合体AP – 3 5をエンドソームから小胞への膜タンパク質を認識し、ソートする可溶性タンパク質複合体でこの戦略を例示する。 AP – 3は、選択的に亜鉛トランスポーターZnT3と脂質キナーゼ、ホスファチジルイノ?…
Acknowledgements
この作品は、VFに国立衛生研究所（NS42599とGM077569）からの補助金によって支えられて。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
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