عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب
Summary
نفاذية الخلية crosslinker DSP [dithiobis – (succinimidyl بروبيونات)] تستقر تفاعلات عابرة وعطوب<em> في الجسم الحي</em> ، والذي يسمح باستخدام صارمة عزلتهم تقنيات تنقية البروتينات المعقدة. هنا نقدم تقنية للخلايا المزروعة في الثقافة يشابك تليها عزل بروتين مناعي المجمعات.
Abstract
بنيت في كثير من الأحيان الطابع الدينامي للأجهزة الخلوية في الجمعيات عابرة البروتين و / أو ضعيفة. هذه التفاعلات تقارب منخفضة تمنع أساليب صارمة لعزل وتحديد شبكات البروتين البروتين حول المصالح. استخدام المواد الكيميائية crosslinkers يسمح للاستقرار انتقائية من التفاعلات عطوب ، وبالتالي تجاوز القيود البيوكيميائية لتنقية. هنا نقدم بروتوكول قابلة للخلايا في ثقافة يستخدم crosslinker homobifunctional مع الذراع هل من 12 (أ) ، dithiobis – (succinimidyl proprionate) (DSP). هو المشقوق DSP بتخفيض ثاني كبريتيد السندات الموجودة في الجزيء. عبر ربط جنبا إلى جنب مع اللوني immunoaffinity من البروتينات في المصالح مع الخرز المغناطيسي يسمح للعزل بروتين المجمعات التي لولاها لا يتحمل تنقية. هذا البروتوكول هو متوافق مع التقنيات العادية لطخة غربية ويمكن زيادتها الامر لتحديد البروتين مطياف الكتلة 1.
ساهم ستيفاني ألف Zlatic واللؤلؤ رايدر خامسا على قدم المساواة في هذا العمل.
Protocol
Discussion
ويستخدم حزب اليسار الديمقراطى ، ونفاذية الغشاء ، crosslinker اختزال كيميائيا مع ذراع هل من 12 ألف إلى استقرار التفاعلات البروتينية عابرة 1،2،3،4. هنا يتضح لنا هذه الاستراتيجية المعقدة مع محول AP – 3 مجمع بروتين قابل للذوبان والتي تعترف أنواع البروتينات في الغشاء من الحو?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة لفودافون (NS42599 وGM077569).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
