Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie
Summary
De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele interacties<em> In vivo</em>, Die hun isolement kunnen met behulp van strenge eiwitcomplex zuiveringstechnieken. Hier presenteren wij een techniek voor het verknopen cellen gekweekt in cultuur, gevolgd door isolatie van eiwitcomplexen door immunoprecipitatie.
Abstract
Het dynamische karakter van mobiele machines wordt vaak gebouwd op voorbijgaande aard en / of zwak eiwit verenigingen. Deze lage affiniteit interacties weg strenge methoden voor de isolatie en identificatie van eiwitten netwerken rond een eiwit van belang. Het gebruik van chemische crosslinkers kan de selectieve stabilisatie van labiele interacties, waardoor het omzeilen van biochemische beperkingen voor zuivering. Hier presenteren wij een protocol vatbaar voor cellen in cultuur die een homobifunctionele crosslinker gebruikt met een spacer arm van 12 Å, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is gesplitst door reductie van een disulfide binding in het molecuul. Cross-linking, gecombineerd met immunoaffiniteitschromatografie van eiwitten van belang met magnetische kralen maakt de isolatie van eiwitcomplexen die anders niet zou weerstaan zuivering. Dit protocol is compatibel met de reguliere western blot technieken en kan worden opgeschaald voor eiwit-identificatie door middel van massaspectrometrie 1.
Stephanie A. Zlatic en Pearl V. Ryder droegen ook voor dit werk.
Protocol
Discussion
DSP, een membraan-permeabel, chemisch reduceerbaar crosslinker met een spacer arm van 12 A wordt gebruikt om tijdelijke eiwit interacties 1,2,3,4 stabiliseren. Hier hebben we een voorbeeld van deze strategie met de adapter complex AP-3 een oplosbare proteïne complex dat herkent en sorteert membraaneiwitten in blaasjes uit endosomen 5. AP-3 bindt selectief aan de zink-transporter ZnT3 en de lipide kinase fosfatidylinositol-4-kinase type II alpha, maar niet transferrine-receptor 1,4,6. We…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health voor VF (NS42599 en GM077569).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
