Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d'affinité immuno-magnétiques
Summary
La cellule perméables réticulant DSP [dithiobis (succinimidyl propionate)] stabilise les interactions transitoires et labiles<em> In vivo</em>, Qui permet leur isolement à l'aide des techniques rigoureuses purification des protéines recombinantes complexes. Nous présentons ici une technique pour les cellules de réticulation en culture suivie de l'isolement de complexes protéiques par immunoprécipitation.
Abstract
La nature dynamique des machineries cellulaires est souvent construit sur des associations de protéines transitoires et / ou faible. Ces interactions faible affinité empêche méthodes rigoureuses pour l'isolement et l'identification des réseaux protéiques autour d'une protéine d'intérêt. L'utilisation de réticulants chimiques permet la stabilisation sélective des interactions labiles, contournant ainsi les limites biochimiques pour la purification. Nous présentons ici un protocole prêtent des cellules en culture qui utilise un réticulant homobifonctionnels avec un bras espaceur de 12 Å, dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP). DSP est clivée par réduction d'un pont disulfure présent dans la molécule. Réticulation combinée avec la chromatographie d'immunoaffinité de protéines d'intérêt avec des billes magnétiques permet l'isolement de complexes protéiques qui, autrement, ne résisterait pas à la purification. Ce protocole est compatible avec les techniques habituelles de western blot et il peut être étendu pour l'identification des protéines par spectrométrie de masse 1.
Stephanie A. Zlatic et Pearl V. Ryder ont contribué également à ce travail.
Protocol
Discussion
DSP, une membrane perméable-, réticulant chimiquement réductibles à un bras espaceur de 12 A est utilisé pour stabiliser les interactions entre protéines passagères 1,2,3,4. Ici, nous témoigne de cette stratégie avec le complexe adaptateur AP-3 d'un complexe protéine soluble qui reconnaît et trie les protéines membranaires dans des vésicules à partir des endosomes 5. AP-3 se lie sélectivement au transporteur de zinc ZnT3 et la kinase lipidique phosphatidylinositol-4-kinase de typ…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à VF (NS42599 et GM077569).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
