בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה
Summary
התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף יציב<em> In vivo</em>, המאפשרת בידוד מחמירים שלהם באמצעות חלבון מורכב טכניקות לטיהור. כאן אנו מציגים טכניקה תאים crosslinking גדל בתרבות בעקבות הבידוד של קומפלקסים חלבונים על ידי immunoprecipitation.
Abstract
האופי הדינמי של machineries הסלולר בנויה לעתים קרובות על עמותות חלבון חולף ו / או חלש. אינטראקציות אלה זיקה נמוכה למנוע שיטות המחמירים עבור בידוד וזיהוי של רשתות חלבון סביב חלבון של עניין. השימוש crosslinkers כימיים מאפשרת ייצוב סלקטיבי של אינטראקציות יציב, ובכך לעקוף את מגבלות ביוכימיות לטיהור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל עבור התאים בתרבית המשתמשת crosslinker homobifunctional עם זרוע spacer של 12 א ', dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP הוא ביקע על ידי הפחתה של קשר disulphide נוכח המולקולה. Cross-linking בשילוב עם כרומטוגרפיה של חלבונים immunoaffinity עניין עם חרוזים מגנטיים מאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים כי אחרת לא יעמוד טיהור. פרוטוקול זה תואם קבוע טכניקות כתם המערבי וזה יכול להיות scaled עד לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה 1.
סטפני א Zlatic ופרל V. ריידר תרמו באופן שווה על עבודה זו.
Protocol
Discussion
DSP, קרום חדיר, crosslinker לצמצם כימית עם זרוע spacer של 12 משמש לייצוב אינטראקציות חלבון חולף 1,2,3,4. כאן אנו שהודגם אסטרטגיה זו מורכבת מתאם AP-3 מורכב חלבון מסיס שמכירה וממיין חלבונים בממברנה לתוך שלפוחית מ endosomes 5. AP-3 נקשר באופן סלקטיבי טרנספורטר אבץ ZnT3 ואת השומנים …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות בארה"ב כדי VF (NS42599 ו GM077569).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
