El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética
Summary
La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e inestable<em> In vivo</em>, Lo que permite su aislamiento con estrictas técnicas de purificación de proteínas complejas. Aquí se presenta una técnica para que las células en un cultivo de entrecruzamiento seguido por el aislamiento de complejos de proteínas por inmunoprecipitación.
Abstract
La naturaleza dinámica de los mecanismos celulares con frecuencia se basa en las asociaciones de proteínas transitoria y / o débiles. Estas interacciones de baja afinidad excluye métodos estrictos para el aislamiento e identificación de las redes de proteínas alrededor de una proteína de interés. El uso de productos químicos reticulantes permite la estabilización selectiva de las interacciones lábiles, evitando así las limitaciones de bioquímica para la purificación. Aquí se presenta un protocolo susceptible de células en cultivo que utiliza un agente de reticulación homobifuncionales con un brazo espaciador de 12 Å, ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP). DSP se separa por reducción de un puente disulfuro en la molécula. La reticulación en combinación con la cromatografía de inmunoafinidad de proteínas de interés con bolas magnéticas permite el aislamiento de complejos de proteínas que de otro modo no resistiría la purificación. Este protocolo es compatible con las técnicas regulares de Western blot y puede ser ampliado para la identificación de proteínas por espectrometría de masas 1.
Stephanie A. Zlatic y Pearl V. Ryder contribuyeron igualmente a este trabajo.
Protocol
Discussion
DSP, una membrana permeable, reticulante químicamente reduce con un brazo espaciador de 12 A se utiliza para estabilizar las interacciones proteína transitoria 1,2,3,4. Aquí se ejemplifican esta estrategia con el complejo adaptador AP-3 un complejo de proteínas solubles, que reconoce y clasifica las proteínas de membrana en vesículas de endosomas 5. AP-3 se une selectivamente al transportador de zinc ZnT3 y la quinasa de lípidos fosfatidilinositol-4-quinasa alfa de tipo II, pero no del recep…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud de VF (NS42599 y GM077569).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
Referências
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
