メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Summary

プロトコルは、メチロトローフ酵母を用いたタンパク質の発現を説明します<em>ピキアパストリス</em>。エレクトロ酵母細胞の調製、に興味のある遺伝子を持つベクトルの変換<em> P.ピキアパストリス</em>と酵母のDNA精製も行われている。ウェスタンブロット分析およびタンパク質の精製は、このタンパク質の発現のプロトコルの最後の手順を構築する。

Abstract

微生物、真核宿主ピキアパストリスのタンパク質発現は、高速で使いやすい発現系で組換えタンパク質を大量に生成する可能性を提供しています。

単細胞微生物P.としてピキアパストリスは、操作が容易であり、高い細胞密度で安価なメディアに急速に成長する。真核生物、P.ビーイングピキアパストリスは、高等真核細胞および得られた組換えタンパク質によって行われる翻訳後修飾の多くは、タンパク質フォールディング、タンパク質分解処理、ジスルフィド結合形成、グリコシル化[1]を受け実行することができます。

メチロトローフ酵母P.としてピキアパストリスは、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝することが可能です。アルコールオキシダーゼ、AOX1、のための強力なプロモーターは、厳重に規制されているとメタノールで誘導し、それが目的の遺伝子の発現のために使用されています。したがって、外来タンパク質の発現は、増殖培地にメタノールを添加することにより誘導することができる[2、3]。

もう一つの重要な利点は、P.パストリスの分泌経路に外来タンパク質を標的とするシグナル配列を使用して、増殖培地中への組換えタンパク質の分泌です。酵母自体がメディアに分泌される内因性のタンパク質やメディアにない追加のタンパク質だけ低いレベルで、異種蛋白質は培地中の全タンパク質の大部分を構築し、タンパク質の精製の手順に従って容易に[3、4]。

（pPICZαA）ここで用いられるベクターは、目的の遺伝子の厳密に調整、メタノール誘導発現のためのAOX1プロモーターを含み、組換えタンパク質の分泌のためのα-因子分泌シグナル、両方E.で選択ゼオシン耐性遺伝子を大腸菌およびピキアおよび c – mycエピトープと組換えタンパク質の検出および精製の ​​ためのポリヒスチジン（6 ×）タグを含むC末端ペプチド。我々はまた、親のベクトル上のc – mycのエピトープを認識する特定の抗 myc – HRP抗体を用いた組換えタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。

Protocol

メチロトローフ酵母 Pichia pastorisにおける組換えタンパク質の発現このプロトコルを開始する前に、P.フレームでクローニングされた目的の遺伝子を持つ必要がありますそれは、ベクトルで、目的の遺伝子の正しい挿入を確認するためにパストリス親ベクトルと配列を決定している。 ステップI：、P.への構築と変形の線?…

Discussion

ホストシステムとしてメチロトローフ酵母Pichia pastorisにを使用してタンパク質発現は、このプロトコルで説明されています。タンパク質は、使用されるクローニングベクターに応じて、培地中に分泌することができます。組換えタンパク質の分泌は、その後の精製が容易になります。しかし、示した条件が増加し、タンパク質レベルで生じることが条件と発現時間の異なる蛋白質と変?…