Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Resumo

O protocolo descreve a expressão da proteína utilizando a levedura metilotróficas Pichia pastoris. A preparação de células de levedura electrocompetent, a transformação do vetor com o gene de interesse em P. pastoris E purificação do DNA de levedura também são realizados. Ocidental blot e purificação de proteínas construir os últimos passos neste protocolo expressão da proteína.

Resumo

Expressão da proteína na Pichia pastoris eucarióticas anfitrião microbiana oferece a possibilidade de gerar grandes quantidades de proteína recombinante em um sistema de expressão rápida e fácil de usar.

Como um microorganismo unicelular P. pastoris é fácil de manipular e cresce rapidamente em meios baratos em altas densidades celulares. Ser um eucariota, P. pastoris é capaz de executar muitas das modificações pós-translacionais executada por células eucarióticas e as proteínas recombinantes obtidas sofrer dobramento de proteínas, processamento proteolítico, formação da ligação dissulfeto e glicosilação [1].

Como um metilotróficas levedura P. pastoris é capaz de metabolizar metanol como única fonte de carbono. O promotor forte para oxidase de álcool, AOX1, é estreitamente regulada e induzidos pelo metanol e é usado para a expressão do gene de interesse. Assim, a expressão da proteína estranha pode ser induzida pela adição de metanol ao meio de crescimento [2, 3].

Outra vantagem importante é a secreção de proteína recombinante para o meio de crescimento, usando uma seqüência de sinais como alvo a proteína estranha à via de excreção de P. pastoris. Com apenas baixos níveis de proteína endógena secretada à mídia pela levedura em si e não proteínas adicionadas aos meios de comunicação, uma proteína heteróloga constrói a maioria das proteínas totais no médio e facilita seguintes etapas de purificação de proteínas [3, 4].

O vetor usado aqui (pPICZαA) contém o promotor AOX1 para bem regulamentada, a expressão de metanol induzida do gene de interesse; o sinal de secreção de α-fator para a secreção da proteína recombinante, um gene de resistência Zeocin para a seleção em ambos os E. coli e Pichia e um peptídeo C-terminal contendo o epítopo c-myc e um polyhistidine tag (6xHis) para a detecção e purificação de proteína recombinante. Mostramos também a análise de western blot a proteína recombinante usando o anticorpo anti-myc-HRP específica reconhecendo o epítopo c-myc no vetor pai.

Protocolo

Expressão de proteínas recombinantes em levedura Pichia pastoris metilotróficas

Antes de iniciar este protocolo você deve ter seu gene de interesse clonado no quadro em um P. vector pastoris pai e tê-lo seqüenciado para verificar a correta inserção do gene de interesse no vector.

Etapa I: Geração de células de levedura electrocompetent, linearização da construção e transformação em P. pastoris

Para esta etapa, você precisará ter as seguintes mídias e as placas na mão:

• Placas YPDS
• 600 mL meio YPD
• água gelada estéril

Discussão

Expressão da proteína usando a levedura Pichia pastoris metilotróficas como um sistema host é descrita neste protocolo. A proteína pode ser secretado para o meio, dependendo do vector de clonagem usado. A secreção da proteína recombinante faz a purificação subseqüente mais fácil. No entanto, as condições mostradas podem ter que ser otimizado para a expressão de proteínas diferentes e mudanças nas condições e tempos de expressão pode resultar em níveis de proteínas. O vetor utilizado neste protocolo tem a caract.......