Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist
Summary
Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Hoewel dit protocol is gebaseerd op de overexpressie van een eiwit, kan het gemakkelijk worden aangepast voor morfologische fenotypes afhankelijk van de onderdrukking van eiwitexpressie. Ons lab is geïnteresseerd in het bestuderen van de signalering eigenschappen van de endocytische adapter eiwit epsin. Om dat doel hebben we gebruik gemaakt van een dominant negatieve benadering, waarin we over-uiting de geconserveerde<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (Enth) domein om te interfereren met de functies van endogene epsin-2 (Ent2 of YLR206W). We zagen dat overexpressie van de Enth domein van Ent2 (ENTH2) in wild-type cellen leidde tot een celdeling defect dat afhankelijk is van de mislocalization van een familie van eiwitten steigers, septins.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe het toezicht op de ontwikkeling van een morfologische fenotype (gistcel niet in staat om een goede celdeling ondergaan) op eiwit overexpressie. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om gistcellen oogst pelletering bij de aanbevolen centrifugeersnelheid als hogere snelheden kunnen beschadigen cellen en obscure resultaten. Methyleenblauw en Calcofluor wit moet worden toegevoegd aan cellen leven vlak voor beeldvorming zoals ze zijn giftig. Deze procedure kan ook…
Acknowledgements
Wij danken Brian G. Coon en Claudia B. Hanna voor nuttige discussies en ondersteuning. Dit project werd ondersteund door start-up middelen van de Dep. van Biologische Wetenschappen, Purdue University aan R. Claudio Aguilar en een American Cancer Society Institutioneel Onderzoek Subsidie aan R. Claudio Aguilar door de Purdue Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Referências
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
