Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante
Summary
Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Bien que ce protocole est basé sur la surexpression d'une protéine, il peut facilement être adapté pour phénotypes morphologiques dépendant de la suppression de l'expression des protéines. Notre laboratoire s'intéresse à l'étude des propriétés de signalisation de la protéine adaptatrice epsin endocytose. À cette fin, nous avons utilisé une approche dominante négative dans laquelle nous surexprimé l'conservée<u> E</u> PSIN<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (ENTH) de domaine dans le but d'interférer avec les fonctions de endogène epsin-2 (Ent2 ou YLR206W). Nous avons observé que la surexpression du domaine de ENTH Ent2 (ENTH2) dans les cellules de type sauvage a conduit à un défaut de la division cellulaire qui dépend de la mauvaise localisation d'une famille de protéines d'échafaudage, septines.
Protocol
Discussion
Ce protocole décrit comment suivre le développement d'un phénotype morphologique (cellule de levure incapable de subir une division cellulaire proprement dite) sur surexpression de la protéine. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de récolter des cellules de levure par granulation à la vitesse de centrifugation recommandé que des vitesses plus rapides peuvent endommager les cellules et les résultats obscurs. Le bleu de méthylène et du blanc de calcofluor doit être ajout…
Acknowledgements
Nous remercions Brian G. Coon et Claudia B. Hanna pour des discussions utiles et de soutien. Ce projet a été soutenu par fonds de démarrage du Dép. des sciences biologiques, Université de Purdue à R. Claudio Aguilar et une société américaine du cancer Subvention de recherche institutionnelle à R. Claudio Aguilar via le Centre de Purdue Cancer.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Referências
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- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
