ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה
Summary
המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. אמנם זה פרוטוקול מבוסס על overexpression של חלבון, זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור פנוטיפים מורפולוגיים תלויים דיכוי של ביטוי חלבון. המעבדה שלנו הוא מעוניין ללמוד את המאפיינים של איתות epsin מתאם endocytic חלבון. כדי לשם כך השתמשנו בגישה שלילית הדומיננטי בה אנו ביטוי יתר של שימור<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (ENTH) תחום על מנת להפריע את הפונקציות של אנדוגני epsin-2 (או Ent2 YLR206W). הבחנו כי overexpression של תחום ENTH של Ent2 (ENTH2) בתאים סוג בר הוביל פגם כי חלוקת התא תלויה mislocalization של משפחה של חלבונים הפיגומים, septins.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח על התפתחות פנוטיפ מורפולוגיים (תא שמרים מסוגלים לעבור חלוקת התא הנכון) על overexpression חלבון. כאשר עושים את זה הליך חשוב לזכור לקצור תאים שמרים ידי pelleting במהירות צנטריפוגה מומלץ מהירויות גבוהות עלולה לגרום נזק לתאים תוצאות מעורפלות. מתילן כחול Ca…
Acknowledgements
אנו מודים בריאן ג'קון וקלאודיה ב חנה לדיונים מועיל ותמיכה. פרויקט זה מומן על ידי סטארט כספים מח'. של מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue ר קלאודיו אגילר לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מענק מחקר ר קלאודיו אגילר באמצעות מרכז Purdue סרטן.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Referências
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
