Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей
Summary
Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>.
Abstract
Удаление гена и белка гиперэкспрессия общие методы изучения функций белков. В этой статье мы опишем протокол для анализа фенотипа развития в зависимости от концентрации белка на население и одноклеточных уровней в<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>. Хотя этот протокол основан на гиперэкспрессия белка, он может быть легко адаптирована для морфологического фенотипа зависит от подавления экспрессии белка. Наша лаборатория заинтересована в изучении свойств сигнализации endocytic epsin белка адаптера. Для этой цели мы использовали доминирующее негативный подход, в котором мы более выраженным сохраняется<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> Т</u> Erminal<u> Н</u> Omology (ENTH) домена для того, чтобы вмешиваться в функции эндогенных epsin-2 (Ent2 или YLR206W). Мы заметили, что гиперэкспрессия ENTH области Ent2 (ENTH2) в клетках дикого типа привело к дефектом клеточного деления, которое зависит от mislocalization семейства леса белков, septins.
Protocol
Discussion
Этот протокол описывает, как следить за развитием морфологических фенотип (дрожжевая клетка не в состоянии пройти надлежащее деление клеток) на белок гиперэкспрессия. При выполнении этой процедуры важно помнить, чтобы урожай дрожжевых клеток путем гранулирования в рекомендуемой ско?…
Acknowledgements
Мы благодарим Брайана Г. Кун и Клаудия Б. Ханна за полезные обсуждения и поддержку. Этот проект был поддержан запуска средства из отд. биологических наук, Университета Пердью Р. Клаудио Агилар и Американского онкологического общества институциональных исследований Грант Р. Клаудио Агилар через Центр Пердью Рака.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Referências
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
