Analys av utveckling av en morfologisk Fenotyp som en funktion av proteinkoncentration i Budding Jäst
Summary
Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>.
Abstract
Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Även om detta protokoll är baserad på överuttryck av ett protein, kan den enkelt anpassas för morfologisk fenotyp beroende på hämning av protein uttryck. Vårt labb är intresserade av att studera signalering egenskaper endocytic adaptern proteinet epsin. För detta ändamål använde vi en dominerande negativa förhållningssätt där vi över-uttryckte bevaras<u> E</u> Psin<u> N</u> -<u> T</u> Erminal<u> H</u> Omology (ENTH) domän för att störa funktioner endogena epsin-2 (Ent2 eller YLR206W). Vi konstaterade att överuttryck av ENTH domän Ent2 (ENTH2) i vild typ celler ledde till en celldelning fel som är beroende av mislocalization av en familj av byggnadsställningar proteiner, septins.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver hur du följa utvecklingen av en morfologisk fenotyp (jäst cell kan genomgå ordentlig celldelning) vid protein överuttryck. När du gör detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att skörda jästceller genom pelletering i rekommenderad centrifugeringsvarvtal som högre hastigheter kan skada celler och oklara resultat. Metylenblått och Calcofluor vita bör läggas till levande celler strax före avbildning som de är giftiga. Detta förfarande kan också lätt anpassas för fenotype…
Acknowledgements
Vi tackar Brian G. Coon och Claudia B. Hanna för hjälpsamma diskussioner och stöd. Projektet fick stöd av uppstart medel från Inst. of Biological Sciences, Purdue University till R. Claudio Aguilar och en American Cancer Society institutionell forskning Bidrag till R. Claudio Aguilar via Purdue Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nocodazole | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | M1404 | |
| Methylene Blue 1% (w/v) | Reagent | VWR International | VW6276-0 | |
| Calcofluor White | Reagent | Sigma (St. Louis, MO) | F3543 | |
| Petroleum Jelly | Reagent | VWR International | VW3339-2 |
Referências
- Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).
- Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway. J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).
- Sherman, F. . Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).
