Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura
Summary
En este video, se describe un procedimiento para la expresión de las bacterias de tipo III efectores en la levadura y la identificación de los fenotipos de efectos inducidos por la inhibición del crecimiento. Fenotipos como puede ser explotada posteriormente para aclarar las funciones efectoras y objetivos.
Abstract
Muchas bacterias Gram-negativas patógenas utilizar un tipo de sistema de secreción de III a trasladar una serie de proteínas efectoras en el citosol de las células huésped. Dentro de la célula, el tipo de efectores III subvertir los procesos celulares del huésped para suprimir la respuesta inmune y promover el crecimiento de patógenos. Numerosos efectores de tipo III de patógenos de plantas y animales de bacterias han sido identificadas hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos de ellos están bien caracterizados. Comprensión de las funciones de estos efectores se ha visto socavada por una combinación de redundancia funcional en el repertorio de efectos de una determinada cepa de bacterias, los efectos sutiles que pueden ejercer para aumentar la virulencia, los roles que posiblemente son específicos para ciertas etapas de la infección, y las dificultades en genética la manipulación de ciertos patógenos. Expresión de tipo III efectores en la levadura en ciernes<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Podría permitir eludir las limitaciones y la ayuda a la caracterización funcional de las proteínas efectoras. Porque el tipo de efectores III a menudo se dirigen los procesos celulares que se conservan entre la levadura y otros eucariotas, su expresión en la levadura puede dar lugar a fenotipos de la inhibición del crecimiento que puede ser aprovechado para aclarar las funciones efectoras y objetivos. Otras ventajas de usar la levadura para estudios funcionales de los efectores bacterianos incluyen su maleabilidad genética, información sobre las funciones previstas de la gran mayoría de sus ORFs, y la disponibilidad de numerosas herramientas y recursos para los experimentos tanto en todo el genoma y en pequeña escala. Aquí hablamos de los factores críticos para el diseño de un sistema de levadura para la expresión de las proteínas bacterianas de tipo III efector. Estos incluyen un promotor apropiado para conducir la expresión del gen efector (s) de interés, el número de copias del gen efector, la etiqueta de epítopo utilizado para verificar la expresión de proteínas, y la cepa de levadura. Se presentan los procedimientos para inducir la expresión de los efectores en la levadura y para verificar su expresión por immunoblotting. Además, se describe un ensayo de manchas en las placas de agar para la identificación de los fenotipos de efectos inducidos por la inhibición del crecimiento. El uso de este protocolo podrá ser extendido al estudio de los factores de patogenicidad entregado en la célula huésped por cualquier patógeno y el mecanismo de translocación.
Protocol
Discussion
En esta presentación, se muestra cómo utilizar la incipiente levadura Saccharomyces cerevisiae como un sistema heterólogo de expresión de tipo III proteínas efectoras bacterianas y cómo identificar efector fenotipos inducidos por la inhibición del crecimiento. Es importante destacar que estos fenotipos puede ser utilizado en las pantallas de genética para identificar supresores del impacto negativo de los efectores de crecimiento de la levadura. Supresores pueden representar blancos directos de los efec…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Ciencias de Israel.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
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