Identificatie van groeiremming fenotypes geïnduceerd door expressie van bacteriële type III Effector in gist
Summary
In deze video, beschrijven we een procedure voor de expressie van bacteriële type III effectoren in gist en het identificeren van effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes. Dergelijke fenotypes kan vervolgens worden benut om effectorfuncties en doelstellingen toe te lichten.
Abstract
Vele Gram-negatieve pathogene bacteriën gebruiken een type III secretie systeem om een suite van effector eiwitten verplaatsen in het cytosol van gastheercellen. In de cel, type III effectoren ondermijnen gastheer cellulaire processen om immuunreacties te onderdrukken en pathogeen groei te bevorderen. Tal van type III effectoren van plantaardige en dierlijke bacteriële ziekteverwekkers zijn geïdentificeerd tot op heden, nog slechts een paar van hen zijn goed gekarakteriseerd. Inzicht in de functies van deze effectoren is ondermijnd door een combinatie van functionele redundantie in de effector repertoire van een bepaalde bacteriestam, de subtiele effecten die zij kunnen uitoefenen om virulentie, rollen die zijn mogelijk voor bepaalde infecties stadia, en moeilijkheden bij het genetisch te verhogen het manipuleren van bepaalde ziekteverwekkers. Expressie van type III effectoren in de gist<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Mogen toestaan dat deze beperkingen te omzeilen en hulp aan de functionele karakterisering van effector eiwitten. Omdat type III effectoren zijn vaak gericht op cellulaire processen die zijn geconserveerd tussen gist en andere eukaryoten, kunnen hun expressie in gist resulteren in groeiremming fenotypes die kunnen worden misbruikt om effectorfuncties en doelstellingen toe te lichten. Extra voordelen aan het gebruik van gist voor functionele studies van bacteriële effectoren zijn hun genetische volgzaamheid, informatie over de voorspelde de functies van de overgrote meerderheid van de ORF, en de beschikbaarheid van een groot aantal tools en middelen voor zowel de genoom-brede en kleinschalige experimenten. Hier bespreken we kritische factoren voor het ontwerpen van een gist-systeem voor de expressie van bacteriële type III effector eiwitten. Deze omvatten een geschikte promotor voor het aandrijven van de expressie van de effector-gen (s) van belang, het aantal kopieën van de effector-gen, de epitoop-tag gebruikt om de eiwit-expressie, en de giststam te verifiëren. We presenteren procedures om de expressie van effectoren in gist te induceren en om hun expressie te verifiëren door immunoblotting. Daarnaast beschrijven we een test op het spotten van agar platen voor de identificatie van effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes. Het gebruik van dit protocol kan worden uitgebreid tot de studie van de pathogeniteit factoren geleverd in de gastheercel door een ziekteverwekker en translocatie mechanisme.
Protocol
Discussion
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de gist Saccharomyces cerevisiae te gebruiken als een heterologe systeem voor de expressie van type III bacteriële effector eiwitten en hoe de effector-geïnduceerde groeiremming fenotypes te identificeren. Belangrijk is, kunnen deze fenotypes worden gebruikt in genetische screens om onderdrukkers van de negatieve impact van effectoren op gist groei te identificeren. Onderdrukkers kunnen vertegenwoordigen hetzij direct doelwit van de effector bestudeerde of eiwitten d…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
