Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l'expression de bactéries de type III Effectors dans la levure
Summary
Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'expression des effecteurs bactériens de type III chez la levure et l'identification des effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. Ces phénotypes peuvent ensuite être exploités pour élucider les fonctions effectrices et cibles.
Abstract
Beaucoup de bactéries pathogènes à Gram-négatif utilisent un système de sécrétion de type III de translocation d'une série de protéines effectrices dans le cytosol des cellules hôtes. Dans la cellule, le type III effecteurs subvertir les processus cellulaires de l'hôte à supprimer les réponses immunitaires et favorisent la croissance des pathogènes. De nombreux types d'effecteurs III de pathogènes végétaux et animaux de bactéries ont été identifiées à ce jour, mais seulement quelques-uns d'entre eux sont bien caractérisés. Comprendre les fonctions de ces effecteurs a été minée par une combinaison de redondance fonctionnelle dans le répertoire de l'effecteur d'une souche bactérienne donnée, les effets subtils qu'ils peuvent exercer à l'accroissement de la virulence, des rôles qui sont peut-être spécifiques à certaines étapes de l'infection, et des difficultés dans génétiquement manipuler certains agents pathogènes. Expression des effecteurs de type III dans la levure bourgeonnante<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Peut permettre de contourner ces limitations et d'aide à la caractérisation fonctionnelle de protéines effectrices. Parce que le type III effecteurs souvent pour cible les processus cellulaires qui sont conservées entre les levures et autres eucaryotes, leur expression dans la levure peut entraîner des phénotypes d'inhibition de croissance qui peuvent être exploitées pour élucider les fonctions effectrices et cibles. Autres avantages à l'utilisation de la levure pour l'étude fonctionnelle des effecteurs bactériens inclure leur traçabilité génétique, des informations sur les fonctions prévues de l'immense majorité de leurs ORF, et la disponibilité de nombreux outils et ressources pour les expériences à la fois l'échelle du génome et à petite échelle. Ici, nous discutons des facteurs essentiels pour la conception d'un système de levure pour l'expression des protéines bactériennes de type III effecteur. Il s'agit notamment un promoteur approprié pour conduire l'expression du gène effecteur (s) d'intérêt, le nombre de copies du gène effecteur, la balise épitope utilisé pour vérifier l'expression des protéines, et la souche de levure. Nous présentons les procédures d'induire l'expression des effecteurs dans la levure et de vérifier leur expression par immunoblot. En outre, nous décrivons un test de taches sur gélose pour l'identification des effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. L'utilisation de ce protocole peut être étendu à l'étude des facteurs de pathogénicité livré dans la cellule hôte par un pathogène et le mécanisme de translocation.
Protocol
Discussion
Dans cette présentation, nous avons illustré la façon d'utiliser la levure Saccharomyces cerevisiae comme un système hétérologue pour l'expression de type III bactérienne des protéines effectrices et comment identifier les effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. Surtout, ces phénotypes peuvent être utilisées dans les écrans de génétique pour identifier des suppresseurs de l'impact négatif sur la croissance des effecteurs de la levure. Suppresseurs peuvent représen…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences d'Israël.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
