Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito
Summary
In questo video, si descrive una procedura per l'espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito e l'individuazione di fenotipi crescita effettrici indotte inibizione. Fenotipi quali può essere successivamente sfruttato per chiarire le funzioni effettrici e gli obiettivi.
Abstract
Molti batteri Gram-negativi patogeni utilizzano un sistema di secrezione tipo III a traslocare una serie di proteine effettrici nel citosol delle cellule ospiti. All'interno della cellula, tipo di effettori III sovvertire processi host cellulari per sopprimere le risposte immunitarie e favorire la crescita dei patogeni. Numerosi effettori tipo III di patogeni animali e vegetali batteriche sono stati identificati fino ad oggi, ma solo pochi di loro sono ben caratterizzati. Comprendere le funzioni di questi effettori è stata compromessa da una combinazione di ridondanza funzionale nel repertorio effettore di un ceppo batterico dato, gli effetti sottili che possono esercitare per aumentare la virulenza, i ruoli che sono forse specifici per alcune fasi dell'infezione, e le difficoltà di geneticamente la manipolazione di determinati agenti patogeni. Espressione di tipo III effettori nel lievito<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Possono permettere aggirare queste limitazioni e gli aiuti alla caratterizzazione funzionale delle proteine effettrici. Perché il tipo III effettori spesso bersaglio processi cellulari che si conservano tra lievito e altri eucarioti, la loro espressione nel lievito può causare fenotipi inibizione della crescita che può essere sfruttato per chiarire le funzioni effettrici e gli obiettivi. Ulteriori vantaggi di utilizzare il lievito per lo studio funzionale di effettori batteriche includono la loro trattabilità genetica, informazioni sulle funzioni prevista della stragrande maggioranza dei loro ORF e la disponibilità di numerosi strumenti e risorse per gli esperimenti, sia genome-wide e su piccola scala. Qui discutiamo i fattori critici per la progettazione di un sistema di lievito per l'espressione delle proteine batteriche di tipo III effettore. Questi includono un promotore appropriata per la guida l'espressione del gene effettore (s) di interesse, il numero di copie del gene effettore, il tag epitopo utilizzati per verificare l'espressione della proteina, e il ceppo di lievito. Vi presentiamo le procedure di indurre l'espressione di effettori nel lievito e per verificare la loro espressione mediante immunoblotting. Inoltre, si descrive un test spotting su piastre di agar per l'identificazione di fenotipi crescita effettrici indotte inibizione. L'utilizzo di questo protocollo può essere estesa allo studio dei fattori di patogenicità consegnato nella cellula ospite da qualsiasi agente patogeno e il meccanismo di traslocazione.
Protocol
Discussion
In questa presentazione, abbiamo illustrato come utilizzare il lievito Saccharomyces cerevisiae in erba come un sistema eterologo per l'espressione di tipo III proteine batteriche effettrici e come identificare effettore indotta fenotipi inibizione della crescita. È importante sottolineare che questi fenotipi possono essere utilizzati in schermi genetici per identificare soppressori dell'impatto negativo di effettori sulla crescita del lievito. Soppressori possono rappresentare bersagli diretti d…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
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