Идентификация фенотипов ингибирование роста индуцированной экспрессии бактериального типа создания эффектов III в Дрожжи
Summary
В этом видео мы опишем процедуру выражения типа бактериальных эффекторов III в дрожжах и идентификации эффекторных вызванных фенотипы ингибирование роста. Такие фенотипов может быть впоследствии использована для выяснения эффекторных функций и задач.
Abstract
Многие грамотрицательные патогенные бактерии используют тип секреции III системы к транслокации набор эффекторных белков в цитоплазме клеток хозяина. В ячейке, типа III эффекторов подорвать хост клеточных процессов для подавления иммунных реакций и способствовать росту возбудителя. Многочисленные типа III эффекторы растений и животных, бактериальных патогенов были определены на сегодняшний день, но лишь немногие из них хорошо подходит. Понимание функций этих эффекторов была подорвана сочетание функциональной избыточностью в эффекторных репертуара данного бактериального штамма, тонкие эффекты, которые они могут оказывать увеличение вирулентности, роли, которые, возможно, характерных для определенных стадиях инфекции, и трудности с генетически манипулирования определенные патогенные микроорганизмы. Выражение типа эффекторов III в почкующихся дрожжей<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> Может позволить обойти эти ограничения и помощи функциональных характеристик эффекторных белков. Поскольку тип III эффекторов часто направлены на клеточные процессы, которые сохраняются между дрожжей и других эукариот, их экспрессии в дрожжах, может привести к задержке роста фенотипы, которые могут быть использованы для выяснения эффекторных функций и задач. Дополнительные преимущества при использовании дрожжей для функциональных исследований бактериальных эффекторов включают их генетической уступчивость, информация о предсказал функции подавляющее большинство их ORF, и наличие многочисленных инструментов и ресурсов, как для генома и небольших экспериментов. Здесь мы обсуждаем важные факторы для проектирования системы дрожжей для выражения бактериального типа III эффекторных белков. К ним относятся соответствующие промоутер за вождение выражение эффекторных гена (ов) интересов, копия число эффекторных гена, эпитопа теги используются для проверки экспрессии белка, и штамм дрожжей. Мы представляем процедуры, чтобы вызвать экспрессию эффекторов в дрожжах и проверить их выражения иммуноблоттинга. Кроме того, мы описываем кровянистые выделения анализа на чашках с агаром для определения эффекторной вызванных фенотипы ингибирование роста. Использование этого протокола может быть продлен до исследования факторов патогенности доставляется в клетки-хозяина любого патогена и транслокации механизма.
Protocol
Discussion
В этой презентации мы показали, как использовать почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE как гетерологичных системы для выражения типа III бактериальных эффекторных белков и как определить эффекторных вызванных фенотипы ингибирование роста. Важно, что эти фенотипы могут быть использов…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Израиль научного фонда.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
