Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş
Summary
Bu video, biz, maya ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi bakteri tip III etkileyiciler ifadesi için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu tür fenotipleri sonradan efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir.
Abstract
Birçok Gram-negatif patojen bakteri, konakçı hücrelerin sitoplazmasında efektör proteinlerin paketi yerini değiştirmek için bir Tip III sekresyon sistemi kullanırlar. Hücre içinde, Tip III etkileyiciler bağışıklık yanıtlarını bastırmak ve patojen büyümesini teşvik ev sahipliği hücresel süreçleri yıkılmasını. Bugüne kadar çok sayıda bitki ve hayvan bakteriyel patojenler tip III etkileyiciler tespit edilmiştir, ama bunlardan sadece birkaçıdır iyi karakterize edilir. Bu effektör fonksiyonlarını anlamak verilen bir bakteri suşunun efektör repertuarında fonksiyonel fazlalık bir kombinasyonu tarafından çürütülmüş, virülans, muhtemelen bazı enfeksiyon aşamalarına özgü rolleri, ve genetik zorluklar artırmak için uygulamayın ince etkileri belirli patojenlere manipüle. Maya tip III etkileyiciler İfadesi<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Efektör proteinlerin fonksiyonel karakterizasyonu, bu sınırlamalar ve yardım engellemeyi izin verebilir. Tip III etkileyiciler sık sık, maya ve diğer ökaryotlar arasında korunmuş hücresel süreçleri hedef için, maya ifade efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir büyüme inhibisyonu fenotipleri neden olabilir. Bakteriyel etkileyiciler fonksiyonel çalışmalar için maya kullanarak Ek avantajlar, genetik izlenebilirliği, onların Orfs büyük çoğunluğunun öngörülen işlevleri hakkında bilgi ve genom ve küçük ölçekli deneyler için çok sayıda araç ve kaynakların kullanılabilirliği içerir. Burada bakteriyel tip III efektör proteinleri ifade için bir maya sistemi tasarımı için kritik faktörler tartışacağız. Bu ilgi efektör gen (ler) ifade sürüş için uygun bir organizatörü, efektör gen kopya sayısı, epitopu etiketi protein ekspresyonu ve maya suşunun doğrulamak için kullanılır. Biz maya etkileyiciler ifade ikna etmek için ve immün ifade doğrulamak için prosedürler mevcut. Buna ek olarak, efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi için agar plaklarına bir lekelenme tahlil açıklar. Bu protokolün herhangi bir patojen ve translokasyon mekanizması tarafından konak hücre içine teslim patojenite faktörleri çalışmaya uzatılabilir.
Protocol
Discussion
Bu sunumda, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae tip III bakteriyel efektör proteinleri ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotipleri nasıl tanımlamak için ifade için heterolog bir sistem olarak nasıl kullanılacağı gösterilmektedir. Önemlisi, bu fenotipleri maya büyüme üzerindeki olumsuz etkisi etkileyiciler bastırıcılarının belirlemek için genetik ekranlarında kullanılan olabilir. Susturmalar doğrudan çalışılan efektör hedefleri veya efektör etkilenen hücresel sür…
Acknowledgements
Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
