Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced
Summary
In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.
Abstract
Viele Gram-negative pathogene Bakterien mit einem Typ III Sekretionssystem für eine Suite von Effektor-Proteine in das Cytosol der Wirtszellen zu translozieren. Innerhalb der Zelle unterwandern Typ III Effektoren Host zelluläre Prozesse, Immunantworten zu unterdrücken und zu fördern Wachstum des Pathogens. Zahlreiche Typ III Effektoren der pflanzlichen und tierischen bakterielle Erreger wurden bisher identifiziert, doch nur wenige von ihnen sind gut charakterisiert. Das Verständnis der Funktion dieser Effektoren wurde durch eine Kombination von funktionellen Redundanz wurde in den Effektor Repertoire eines bestimmten Bakterienstamm untergraben, die subtilen Wirkungen, die sie ausüben, um Virulenz, Rollen, die möglicherweise spezifisch für bestimmte Infektionen Stufen sind, und Schwierigkeiten bei der genetisch erhöhen können Manipulation bestimmter Krankheitserreger. Expression von Typ III Effektoren in der Hefe<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Kann damit umgehen, werden diese Beschränkungen und Hilfe für die funktionelle Charakterisierung von Effektor-Proteine. Da Typ-III-Effektoren häufig Ziel zelluläre Prozesse, die zwischen Hefe und anderen Eukaryoten konserviert sind, kann ihre Expression in Hefe in Wachstumshemmung Phänotypen, die ausgenutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele klären kann führen. Zusätzliche Vorteile bei der Verwendung Hefe für funktionelle Studien von bakteriellen Effektoren gehören ihre genetische Lenkbarkeit Informationen über prognostizierte Funktionen der großen Mehrheit ihrer ORFs und die Verfügbarkeit von zahlreichen Tools und Ressourcen für genomweite und kleine Experimente. Hier diskutieren wir kritische Faktoren für die Gestaltung einer Hefe-System für die Expression von bakteriellen Typ III Effektor-Proteine. Dazu gehören einem geeigneten Promotor für die Expression des Effektors Gen (e) von Interesse, die Kopienzahl der Effektor-Gen, verwendet das Epitop-Tag-Protein-Expression und der Hefestamm zu überprüfen. Wir präsentieren Verfahren zur Expression von Effektoren in Hefe zu induzieren und deren Ausdruck durch Immunoblot zu überprüfen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Spotting-Assay auf Agarplatten für die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Die Verwendung dieses Protokoll kann die Studie von Pathogenitätsfaktoren in die Wirtszelle durch keine Erreger und Translokation Mechanismus geliefert erweitert werden.
Protocol
Discussion
In diesem Vortrag dargestellt wir, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als einem heterologen System für die Expression des Typ III bakteriellen Effektor-Proteine und wie Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen identifizieren können. Wichtig ist, dass diese Phänotypen in genetischen Screens genutzt werden, um Unterdrücker der negativen Auswirkungen von Effektoren auf das Wachstum der Hefe zu identifizieren. Suppressors darstellen können entweder direkte Ziele des Effektors studiert o…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
Referências
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
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