Импульсно-погони Анализ N-связанных цепей сахар из гликопротеинов в клетках млекопитающих
Summary
Мы опишем метод анализа изменения N-связанных гликанов через ранней жизни гликопротеинов после их биосинтеза в клетках млекопитающих. Это достигается методом широтно-погони анализ метаболически помечены гликанов, ферментативные освобождения из гликопротеинов и обследование с помощью ВЭЖХ.
Abstract
Крепление Glc<sub> 3</sub> Мужчина<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Предшественником олигосахарид зарождающимся полипептидов в ER является распространенной модификации для секреторных белков. Хотя эта модификация была замешана в ряде биологических процессов, дополнительные аспекты его функции появляются, с недавним свидетельством его роль в производстве сигналы гликопротеин контроля качества и торговлей людьми. Таким образом, явления, связанные с N-связанных гликанов и их переработки в настоящее время интенсивно исследуются. Методы, которые были недавно разработаны для анализа протеомных значительно улучшились характеристики гликопротеин N-связанных гликанов. Тем не менее, они не обеспечивают понимание динамики переработке сахара цепи участие. Для этого, маркировка и широтно-погони протоколы анализа используются, что, как правило, сложны и дают очень низкие урожаи. Мы описываем здесь простой метод выделения и анализа метаболически помечены N-связанных олигосахаридов. Протокол основан на маркировке клеток с [2 -<sup> 3</sup> H] маннозы, денатурирующих лизиса и ферментативного освобождения олигосахаридов, либо из специально иммунопреципитации белков интереса или из общего пула гликопротеин путем последовательного лечения с эндо-H и N-гликозидазы F, а затем молекулярной фильтрации (Amicon). В этом методе изолированных олигосахариды служить входом для ВЭЖХ анализа, которая позволяет дискриминацию между различными гликана структур в зависимости от количества моносахаридов единиц, включающих них, с разрешения одного моносахарида. Используя этот метод, мы смогли изучить высокой маннозы N-связанных олигосахаридов профили от общего числа гликопротеины клетки после импульсно-погони в нормальных условиях и под протеасом торможения. Эти профили были сопоставлены с полученными от иммунопреципитации ЭР-связанных деградации (Erad) подложки. Наши результаты показывают, что большинство NIH 3T3 сотовой гликопротеины являются относительно стабильными и, что большинство их олигосахариды отделаны к человеку<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. В отличие от этого, нестабильная субстратов Erad отделаны к человеку<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> И гликопротеины подшипник этих видов накапливаются на торможение протеасомной деградации.
Protocol
Discussion
Импульсно-погони анализ гликанов в живых клетках с разделением ВЭЖХ обеспечивает метод для изучения динамики олигосахарид структурных изменений на протяжении всей жизни гликопротеин. Существует все больше доказательств, что такие изменения являются участвующих в производстве сигн?…
Acknowledgements
Мы благодарим Zehavit Френкеля и Сандра Толчинский для оказания технической помощи. Исследования, связанные с этим Работа выполнена при поддержке грантов от Израиля научного фонда (1229/07) и германо-израильского проекта сотрудничества (DIP-DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Referências
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
