哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析
Summary
我々は、哺乳類細胞におけるそれらの生合成後の糖タンパク質の初期の生活を通じて、N -結合型グリカンの変化の分析のための方法を説明します。これは、代謝的に標識した糖鎖、糖タンパク質およびHPLCによる検討からの酵素遊離のパルス – チェイス分析によって達成されます。
Abstract
Glcの添付ファイル<sub> 3</sub>マン<sub> 9</sub> N -アセチルグルコサミン<sub> 2</subERでの新生ポリペプチドに対するオリゴ糖>前駆体は分泌蛋白質に共通の変更です。この変更は、いくつかの生物学的プロセスに関与されたが、その機能の追加の側面は、糖タンパク質の品質管理や人身売買のシグナルの生産におけるその役割の最近の証拠で、浮上している。従って、N -結合型糖鎖とその処理に関連する現象が集中的に研究されている。最近プロテオーム解析のために開発されてきた方法は、大幅に糖タンパク質のN -結合型グリカンの特性を改善している。それにもかかわらず、彼らは関与する糖鎖プロセッシングの動態への洞察を提供していません。このために、ラベリングやパルスチェイス解析プロトコルは通常、複雑であり、非常に低い収率を与えることに使用されます。ここでは、代謝的に標識したN -結合型糖鎖の単離と解析のためのシンプルな方法を説明します。プロトコルは[2細胞のラベリングに基づいている -<sup> 3</sup> H関心のどちら特に免疫沈降したタンパク質からまたは分子濾過（アミコン）に続いて遠藤HとN -グリコシダーゼFと順次治療による一般的な糖タンパク質プールから]マンノース、変性溶解し、オリゴ糖の酵素的放出。この方法では分離されたオリゴ糖は単糖類の分解能で、それらを含有する単糖単位の数に応じて様々な糖鎖構造の間に差別を可能にするHPLC分析のための入力として機能します。この方法を用いて、我々は通常の状態にし、プロテアソーム阻害下でパルスチェイス後の全細胞の糖タンパク質の高マンノースN -結合型糖鎖のプロファイルを研究することができた。これらのプロファイルは、免疫沈降した小胞体関連分解（ERAD）基板から得られたものと比較した。我々の結果は、ほとんどのNIH 3T3細胞の糖タンパク質は比較的安定していることと、それらのオリゴ糖の大部分が男にトリミングされていることを示唆している<sub> 9月8日</sub> N -アセチルグルコサミン<sub> 2</sub>。対照的に、不安定なERADの基質は、人間にトリミングされています<sub> 6月5日</sub> N -アセチルグルコサミン<sub> 2</subこれらの種をもつ>と糖タンパク質は、プロテアソームによる分解の阻害により蓄積する。
Protocol
Discussion
パルスチェイス生細胞における糖鎖の分析HPLC分離とは、糖タンパク質の一生を通じてオリゴ糖の構造変化のダイナミクスを研究するための方法を提供する。このような変化がERのフォールディング、品質管理および売買システム2-5の信号を生成に関与していることを成長証拠がある。方法はないだけ関心のある特定の糖タンパク質のためだけでなく、我々は対照的な、特定のERADの基?…
Acknowledgements
我々は技術支援のためにZehavitフレンケルとサンドラTolchinskyに感謝。この作品に関連する研究は、イスラエル科学財団（1229年〜1207年）とドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP – DFG）からの補助金によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Referências
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
