Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen
Summary
We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.
Abstract
Bevestiging van de Glc<sub> 3</sub> Man<sub> 9</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> Voorloper oligosaccharide op beginnende polypeptiden in de ER is een gebruikelijke aanpassing voor de secretorische eiwitten. Hoewel deze wijziging was betrokken bij verschillende biologische processen, zijn bijkomende aspecten van zijn functie in opkomst, met de recente bewijs van haar rol in de productie van signalen voor glycoproteïne kwaliteitscontrole en mensenhandel. Zo worden verschijnselen in verband met N-gekoppelde glycanen en hun verwerking intensief onderzocht. Methoden die onlangs zijn ontwikkeld voor proteoomanalyse zijn sterk verbeterd de karakterisering van glycoproteïne N-gekoppelde glycanen. Toch hebben ze geen inzicht in de dynamiek van de suiker betrokken keten verwerking. Voor deze, de etikettering en de pulse-chase analyse protocollen die worden gebruikt die zijn meestal complexe en geven een zeer lage opbrengsten. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor de isolatie en analyse van metabolisch gelabeld N-gekoppelde Oligosacchariden. Het protocol is gebaseerd op de etikettering van cellen met [2 -<sup> 3</sup> H] mannose, denaturerende lysis en enzymatische afgifte van de Oligosacchariden van ofwel een specifiek immunogeprecipiteerd eiwit van belang of uit de algemene glycoproteïne zwembad door opeenvolgende behandelingen met endo H en N-glycosidase F, gevolgd door moleculaire filtratie (Amicon). In deze methode wordt de geïsoleerde oligosaccharides dienen als input voor HPLC-analyse, die discriminatie tussen de verschillende glycaan structuren kunnen op basis van het aantal monosaccharide-eenheden die ze bevatten, met een resolutie van een monosaccharide. Met behulp van deze methode waren we in staat om hoge mannose N-gekoppelde oligosaccharide profielen van totale cel glycoproteïnen studie na pulse-chase in normale omstandigheden en onder proteasoomremming. Deze profielen werden vergeleken met die verkregen uit een immunogeprecipiteerd ER-geassocieerde degradatie (ERAD) substraat. Onze resultaten suggereren dat de meeste NIH 3T3-cellulaire glycoproteïnen zijn relatief stabiel is en dat de meeste van hun oligosacchariden zijn bijgesneden tot Man<sub> 9-8</sub> GlcNAc<sub> 2</sub>. In tegenstelling, zijn instabiel ERAD substraten bijgesneden tot Man<sub> 6-5</sub> GlcNAc<sub> 2</sub> En glycoproteïnen met deze soorten zich ophopen bij de remming van de proteasomale degradatie.
Protocol
Discussion
De pulse-chase analyse van suikers in levende cellen met HPLC-scheiding biedt een methode voor het bestuderen van de dynamiek van oligosaccharide structurele veranderingen gedurende de gehele levensduur van een glycoproteïne. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat dergelijke wijzigingen zijn betrokken bij de productie van de signalen voor ER vouwing, kwaliteitscontrole en-handel systemen 2-5. De methode kan worden toegepast, niet alleen voor een specifiek glycoproteïne van belang, maar ook voor het analyseren…
Acknowledgements
Wij danken Zehavit Frenkel en Sandra Tolchinsky voor technische bijstand. Onderzoek in verband met dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (1229-1207) en de Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP-DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 600E Multisolvent delivery System controller | Waters | WAT062710 | ||
| Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography) | Merck Bioscience | 1.0003 | ||
| Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30 | Millipore | UFC503024 or 4208 | ||
| Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor | Eppendorf | 5301 000.016 | ||
| Dialyzed Foetal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco Invitrogen Cell Culture | 41965039 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – glucose free | Sigma-Aldrich | D5030 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | ||
| EDTA disodium salt (Titriplex Iii) | Merck | 1084180250 | ||
| Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml) | New England Biolabs | p0703S | ||
| Foetal Calf Serum (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | ||
| Frac-100 fraction collector | Amersham Biosciences | 18-1000-77 | ||
| LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems | Beckman Coulter | 510720 | ||
| Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol) | PerkinElmer Life Sciences | NET570A | ||
| N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132) | Calbiochem | 474790 | ||
| N-glycosidase F (1000 units/ml) | Roche | 11365177 | ||
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | ||
| NIH 3T3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1658 | ||
| Opti-Flour | PerkinElmer Life Sciences | 6013199 | ||
| Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC) | Fluka | 79607 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | ||
| Protein A-Sepharose beads | Repligen | IPA300 | ||
| Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6 | ||||
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Bio-RAD | 161-0301 | ||
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | ||
| Sodium pyruvate solution (100mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | ||
| Triton X-100 | BDH | 306324N | ||
| Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | ||
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside | ||||
| NIH 3T3 stably expressing H2a 6 | ||||
| Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS | ||||
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Referências
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2. J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).
- Hosokawa, N. Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I. J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).
- Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure. J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).
- Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide. J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).
