نحن تقرير وضع نظام للتصوير الآلي وتحليل الأجنة وراثيا في لوحات multiwell الزرد. هذا يدل على القدرة على قياس آثار الجرعة تعتمد على جزيء صغير ، BCI ، على التعبير عامل نمو الخلايا الليفية الجين مراسل وتوفير التكنولوجيا لإنشاء عالية الإنتاجية شاشات الكيميائية الزرد.
علينا أن نظهر صورة لتطبيق يستند إلى منهجية عالية المحتوى (HCS) فحص لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تعدل مسار جمعية جيل المستقبل / RAS / MAPK في الأجنة الزرد. الجنين الزرد هو نظام مثالي للشاشات الكيميائية في الجسم الحي عالية المحتوى. الجنين 1 ايام العمر حوالي 1MM في القطر ، ويمكن بسهولة المحتشدة في لوحات 96 – جيدا ، وشكل موحد للفحص إنتاجية عالية. خلال اليوم الأول للتنمية ، والأجنة وشفافة مع معظم الأجهزة الرئيسية الحالية ، وبالتالي تمكين التصور من خلال تشكيل النسيج الجنيني. أتمتة كاملة من شاشات الزرد الكيميائية لا تزال تمثل تحديا ، ولكن ، لا سيما في مجال تطوير آلية الحصول على الصور وتحليلها. نحن ولدت من قبل خط مراسل المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة نشاط جمعية جيل المستقبل وأثبتت جدواها في شاشات الكيميائية<sup> 1</sup>. لوضع منهجية لشاشات عالية الإنتاجية الحي كله ، وضعنا نظاما للتصوير الآلي وتحليل الأجنة الزرد في 24-48 التسميد آخر ساعة (HPF) في 96 – جيدا لوحات<sup> 2</sup>. في هذا الفيديو نسلط الضوء على إجراءات arraying الأجنة وراثيا في لوحات multiwell في 24hpf وإضافة جزيء صغير (بي سي آي) الذي يشير hyperactivates جمعية جيل المستقبل<sup> 3</sup>. والمحتضنة لوحات لمدة 6 ساعات يليه إضافة إلى tricaine تخدير اليرقات قبل التصوير الآلي الجزيئية على أجهزة المسح الضوئي ليزر ImageXpress الترا القارئ HCS مبائر. تتم معالجة الصور بواسطة برنامج مطور Definiens باستخدام تكنولوجيا شبكة الخوارزمية الإدراك أننا المتقدمة لكشف وتحديد التعبير عن GFP في رؤوس الأجنة وراثيا. في هذا المثال نسلط الضوء على قدرة الخوارزمية لقياس الجرعة التي تعتمد على آثار BCI مراسل GFP الجينات في الأجنة المعالجة.
ومن العوامل الرئيسية التي تحد من الإنتاجية من شاشات الكيميائية الزرد هو عدم وجود منهجية لعملية منهجية 96 – جيدا لوحات التصوير والتحليل. لأن الصور من الكائنات المتعددة الخلايا معقدة ، وعلى النقيض منخفضة ، وغير متجانسة في طبيعتها ، الموجودة خوارزميات تحليل الصور تفشل لكشف وتحديد هياكل محددة داخل الكائن الحي. نشرت معظم الزرد الكيميائية تنطوي على الشاشات المرئية لذلك فحص الآبار الفردية عن طريق العاملين المخلصين في جميع أنحاء الداخلي. هذا يمنع عادة توليد قراءات رقمية كاملة وحفظها في ملفات صور الشاشة والبيانات. وعلاوة على ذلك ، وتقييم دليل يلغي العديد من المزايا الرئيسية الصورة القائمة على الفرز ، أي القدرة على إجراء تحليلات بأثر رجعي لأداء الشاشة ، لدراسة التغيرات المظهرية التي لم يتم التركيز الأساسي للحملة الفحص (على سبيل المثال ، سمية أو عيوب التنموية) والعبور إلى المرجع فحص البيانات مع الشاشات الماضي أو في المستقبل باستخدام مكتبة المجمع نفسه.
في هذا التقرير نسلط الضوء على منهجية التصوير الآلي وتحليل الأجنة الزرد في لوحات multiwell دون تدخل المستخدم. نحن التقاط الصور آليا على الليزر الترا ImageXpress المسح مبائر القارئ (الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل كاليفورنيا) لتيراغرام صورة (dusp6 : d2EGFP) pt6 الأجنة في 96 لوحات جيدة وضعت خوارزمية تحليل الصور استنادا Definiens 'الإدراك تكنولوجيا الشبكة التي GFP كميا التعبير في رؤوس الأجنة وراثيا. طريقة تسليم الردود متدرج وكميا في نشاط الجسم الحي من جزيء صغير منشط للإشارة جمعية جيل المستقبل. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع الثاني ArrayScan epifluorescence المستندة (Cellomics شركة ، بيتسبرغ السلطة الفلسطينية) الذي يوثق أنه من الممكن لتنفيذ آلية التقاط الصور من الأجنة الزرد على مجموعة متنوعة من القراء لوحة المتاحة تجاريا 2. القضاء على وضع منهجية لتحليل الصور تلقائيا الكائنات متعددة الخلايا على الحاجة لتسجيل مرئي من قبل المراقب الإنسان وتمكين الجيل وحفظ البيانات والصور الرقمية لتحليل بأثر رجعي ومقارنات مع شاشات المستقبل.
ويتم تمويل هذا العمل من قبل معاهد الصحة القومية / المعاهد الوطنية للصحة (1R01HD053287) لHukriede ، NCI / المعاهد الوطنية للصحة (P01 CA78039) لفوغت ، وNHLBI / المعاهد الوطنية للصحة (1R01HL088016) لتسانغ.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |