我们报告的自动成像系统和分析在多孔板的转基因斑马鱼的胚胎的发展。这表明成纤维细胞生长因子记者的基因表达的能力来衡量的一个小分子,BCI,剂量依赖效应,并提供技术建立高通量的斑马鱼化工屏幕。
我们演示了基于图像的高内涵筛选(HCS)的方法来识别,可以调节斑马鱼的胚胎中的FGF / RAS / MAPK通路的小分子的应用程序。斑马鱼的胚胎是在体内高含量的化学屏幕的理想系统。 1日龄胚胎直径约1mm,可以很容易地排列到96孔板,为高通量筛选的标准格式。在发展的第一天,胚胎透明,大部分目前的主要器官,从而使组织形成的胚胎发育过程中的可视化。然而,斑马鱼化工屏幕的完整的自动化仍然是一个挑战,特别是在自动化图像采集和分析的发展。我们先前生成的转基因绿色荧光蛋白(GFP)的FGF活动的控制下,记者一行表示,并展示了在化学屏幕它们的效用<sup> 1</sup>。要建立高吞吐量的整个机体屏幕的方法,我们开发了96孔板自动成像系统和分析斑马鱼的胚胎在受精后24-48小时(HPF)<sup> 2</sup>。在这个视频中,我们突出24hpf转基因胚胎阵列多孔板的程序,除了一个小分子(BCI)hyperactivates FGF信号<sup> 3</sup>。板孵育6小时tricaine此外,麻醉一个分子器件ImageXpress超激光扫描共聚焦的HCS读者幼虫前自动成像。图像处理Definiens的认知网络技术的算法,我们开发的检测和定量表达绿色荧光蛋白转基因胚胎的头的软件开发人员使用。在这个例子中,我们突出了该算法的能力来衡量处理的胚胎中GFP报告基因表达的BCI剂量依赖效应。
限制的斑马鱼化工屏幕的吞吐量的一个主要因素是缺乏系统的成像和分析过程的96孔板的方法。由于是复杂的多细胞生物体的图像,低对比度和性质异构,现有的图像分析算法故障检测和量化机体内部的具体结构。因此,大多数公布的斑马鱼化工屏幕涉及视觉由专门人员检查整个过程中个别井。这通常可以防止的数值读数生成和屏幕图像和数据的完整归档。此外,评价手册消除图像为基础的筛查,即能力,画面表现进行回顾性分析,研究表型的变化,没有甄别运动(如毒性或发育缺陷)的主要重点和跨的几个关键优势参考过去或将来的屏幕上使用相同的化合物库的筛选数据。
在这份报告中,我们强调和斑马鱼的胚胎在多孔板自动成像分析的方法,无需用户干预。 PT6胚胎在96孔板,并开发了一种图像分析算法基于Definiens公司的认知网络技术,量化的GFP:我们ImageXpress超激光扫描共聚焦阅读器(分子器件,位于美国加州Sunnyvale)的形象TG(d2EGFP dusp6)自动图像捕捉表达的转基因胚胎的头。该方法提供了分级响应和FGF信号的一种小分子活化剂在体内的活动量化。与epifluorescence基于ArrayScan II(Cellomics公司,匹兹堡PA)获得了类似的结果证明它是可以实现的各种市售板读者2斑马鱼胚胎的自动图像捕获。方法论的发展,自动分析多细胞生物体图像消除由人类观察者视觉得分的需要,并启用了回顾性分析,并与未来的屏幕比较的数值数据和图像的生成和归档。
这项工作是由Hukriede,NCI / NIH(P01 CA78039)沃格特,NHLBI /美国国立卫生研究院(1R01HL088016)曾NICHD的/美国国立卫生研究院(1R01HD053287)。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |