Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.
Dimostriamo l'applicazione di image-based di alto contenuto di screening (HCS) metodologia per identificare piccole molecole in grado di modulare l'FGF / RAS / MAPK in embrioni di zebrafish. L'embrione di zebrafish è un sistema ideale per in vivo di alto contenuto schermi chimici. L'1-day embrione è di circa 1 mm di diametro e può essere facilmente disposte in piastre a 96 pozzetti, un formato standard per lo screening ad alto rendimento. Durante il primo giorno di sviluppo, gli embrioni sono trasparenti con la maggior parte dei principali organi presenti, permettendo così la visualizzazione della formazione di tessuto durante l'embriogenesi. La completa automazione degli schermi chimici zebrafish è ancora una sfida, tuttavia, in particolare nello sviluppo di acquisizione delle immagini e analisi automatizzate. Abbiamo generato in precedenza una linea giornalista transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di attività FGF e dimostrato la loro utilità negli schermi chimici<sup> 1</sup>. Per stabilire la metodologia per schermi ad alta velocità intero organismo, abbiamo sviluppato un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di embrioni di zebrafish a 24-48 ore dopo la fecondazione (HPF) in piastre da 96 pozzetti<sup> 2</sup>. In questo video possiamo evidenziare le procedure per arraying embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli a 24hpf e l'aggiunta di una piccola molecola (BCI) che hyperactivates FGF segnalazione<sup> 3</sup>. Le piastre vengono incubate per 6 ore seguita dall'aggiunta di tricaine per anestetizzare le larve prima di imaging automatizzato su un Molecular Devices ImageXpress Ultra scansione laser confocale HCS lettore. Le immagini vengono elaborate da un software Developer Definiens utilizzando un algoritmo di rete Cognition La tecnologia che abbiamo sviluppato per individuare e quantificare l'espressione di GFP nelle teste degli embrioni transgenici. In questo esempio si segnala la capacità dell'algoritmo di misura dose-dipendente della BCI effetti sull'espressione dei geni GFP giornalista negli embrioni trattati.
Un fattore importante che limita la velocità di schermi chimici zebrafish è la mancanza di una metodologia per elaborare sistematicamente le piastre a 96 pozzetti per l'imaging e analisi. Poiché le immagini degli organismi multicellulari sono complessi, a basso contrasto, e di natura eterogenea, esistenti algoritmi di analisi delle immagini non riescono a individuare e quantificare le strutture specifiche all'interno dell'organismo. La maggior parte pubblicati schermi chimici zebrafish quindi coinvolgere l'esame visivo di singoli pozzi da parte di personale dedicato tutta la procedura. Questo impedisce che di solito la generazione di letture numeriche e una completa archiviazione delle immagini dello schermo e dati. Inoltre, la valutazione manuale eliminates alcuni vantaggi chiave di image-based di screening, cioè la capacità di condurre analisi retrospettive di prestazioni dello schermo, per esaminare i cambiamenti fenotipici che non erano l'obiettivo primario della campagna di screening (per esempio, la tossicità o difetti di sviluppo) e di attraversare di riferimento dei dati di screening con schermi passate o future utilizzando la stessa libreria composto.
In questo rapporto si evidenzia la metodologia per l'imaging e l'analisi automatizzata di embrioni di zebrafish in piastre a pozzetti multipli senza l'intervento dell'utente. Noi la cattura delle immagini automatico su un laser a scansione confocale ImageXpress Ultra lettore (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) per l'immagine Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embrioni in 96 pozzetti e sviluppato un algoritmo di analisi di immagine basato sulla tecnologia Cognizione Definiens 'di rete che GFP quantificati espressione nelle teste degli embrioni transgenici. Il metodo consegnato risposte classificato e quantificato in vivo di una piccola molecola attivatore di FGF segnalazione. Risultati simili sono stati ottenuti con l'epifluorescenza a base ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) documenta che è possibile implementare la cattura automatica delle immagini di embrioni di zebrafish su una varietà di lettori di piastre in commercio 2. Lo sviluppo della metodologia per analizzare automaticamente le immagini organismo pluricellulare eliminato la necessità di segnare visivo da un osservatore umano e ha permesso la generazione e l'archiviazione di dati numerici e immagini per l'analisi retrospettiva e confronti con schermi futuro.
Questo lavoro è finanziato dal NICHD / NIH (1R01HD053287) per Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) per Vogt, e NHLBI / NIH (1R01HL088016) per Tsang.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |