我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。
我々は、ゼブラフィッシュの胚ではFGF / RAS / MAPK経路を調節できる小さな分子を識別するためのイメージベースのハイコンテンツスクリーニング(HCS)方法論の適用を示しています。ゼブラフィッシュの胚は、生体内の高含有量化学物質の画面で最適なシステムです。 1日齢の胚は、直径1mm程度であり、簡単に96ウェルプレート、ハイスループットスクリーニングのための標準形式に配列することができます。開発の最初の日の間に、胚は、このように、胚発生時の組織形成の可視化を可能にする、現在の主要な臓器のほとんどが透明です。ゼブラフィッシュの化学画面の完全な自動化は、特に自動化されたイメージの取得と分析の開発では、しかしながら、依然として課題です。我々は以前にFGF活性の制御下に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックレポーターのラインを生成し、化学物質の画面でその有用性を実証<sup> 1</sup>。ハイスループット生物全体のスクリーンのための方法論を確立するために、我々は、96ウェルプレートで24〜48時間の後の受精(HPF)でゼブラフィッシュ胚の自動化された画像と解析のためのシステムを開発<sup> 2</sup>。このビデオでは、24hpfでマルチウェルプレートにトランスジェニック胚をアレーする際の手順を強調表示し、FGFシグナリングをhyperactivates小分子(BCI)の追加<sup> 3</sup>。プレートは、モレキュラーデバイスImageXpressウルトラレーザースキャニング共焦点HCSリーダー上で自動化されたイメージングする前に幼虫を麻酔tricaineを加えて6時間インキュベートする。画像は、我々はトランスジェニック胚の頭部にGFPの発現を検出し、定量化するために開発された認知ネットワーク技術のアルゴリズムを使用して定義するものの開発者のソフトウェアによって処理されます。この例では、治療胚におけるGFPレポーター遺伝子の発現にBCIの用量依存的効果を測定するためにアルゴリズムの能力を強調。
ゼブラフィッシュの化学物質の画面のスループットを制限する主な要因は、体系的にプロセスのイメージングと解析のための96ウェルプレートへの方法論の欠如です。多細胞生物の画像は、複雑な低コントラスト、そして自然の中で異質なので、既存の画像解析アルゴリズムは、生体内の特定の構造を検出し、定量化に失敗する。ほとんど公開されてゼブラフィッシュの化学物質の画面では、そのための手順全体に専用の担当者による個々のウェルの目視検査を含む。これは通常、数値リードアウトの生成と画面イメージとデータのアーカイブを完全に防ぐことができます。また、マニュアルの評価、すなわちイメージベースのスクリーニング、、スクリーンの性能のレトロスペクティブ分析を実施するためのスクリーニングキャンペーン(例えば、毒性または発達障害)の主な焦点ではなかった表現型の変化を調べ、交差する機能のいくつかの重要な利点を排除同じ化合物ライブラリーを使用して過去や未来の画面で参照スクリーニングデータ。
本報告書では、ユーザーの介入なしに、マルチウェルプレート内のゼブラフィッシュ胚の自動化されたイメージングと解析のための方法論を強調する。我々のイメージTG(dusp6:d2EGFP)に焦点リーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)のスキャンImageXpressウルトラレーザーで自動化された画像キャプチャ96ウェルプレートでPT6胚と定義するもの"認知ネットワーク技術定量化することGFPに基づいた画像解析アルゴリズムを開発トランスジェニック胚の頭部で発現。方法は、段階的応答を達成し、小分子FGFシグナル伝達の活性化因子のin vivo活性の定量化。同様の結果がそれは市販のプレートリーダー2の様々なゼブラフィッシュ胚の自動化された画像キャプチャを実現することが可能であることを文書化する落射蛍光ベースのArrayScan II(セロミクス社、ピッツバーグPA)が得られた。自動的に多細胞生物の画像を分析する方法論の開発は、人間の観察によって、視覚スコアリングの必要性を排除し、将来のスクリーン付きレトロスペクティブ分析と比較のための数値データと画像の生成とアーカイブを有効にする。
この作品は、ツァンにHukriede、NCI / NIH(P01 CA78039)フォークトに、とNHLBI / NIH(1R01HL088016)にNICHD / NIH(1R01HD053287)によって運営されている。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |