Мы сообщаем о развитии системы автоматизированного визуализации и анализа данио трансгенных эмбрионов в виде пластин многоямного. Это демонстрирует возможность измерения зависит от дозы эффект маленькая молекула, BCI, на фактор роста фибробластов экспрессии гена репортера и предоставлять технологию для создания высокой пропускной экраны данио химических веществ.
Мы демонстрируем применение на основе образа высоким содержанием скрининга (ЖКХ) методологии для идентификации малых молекул, которые могут модулировать FGF / РАН / МАРК пути у эмбрионов данио. Данио эмбрион является идеальной системой для прижизненного высоким содержанием химических экранов. 1-дневного эмбриона составляет около 1 мм в диаметре и может быть легко одетые в 96-луночных планшетах, стандартный формат для высокопроизводительного скрининга. В первый день развития эмбриона являются прозрачными с большинством основных органов настоящее время, что позволяет визуализировать ткани образование во время эмбриогенеза. Полная автоматизация экраны данио вещество по-прежнему проблемой, однако, в частности, в разработке автоматизированных приобретение и анализа изображений. Мы ранее сгенерированный трансгенной линии репортеру, что выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем активности FGF и продемонстрировали свою полезность в химической экраны<sup> 1</sup>. Чтобы установить методологию высокой пропускной весь экран организма, мы разработали систему для автоматизированного получения изображений и анализа данио эмбрионов на 24-48 часа после оплодотворения (HPF) в 96-луночных планшетах<sup> 2</sup>. В этом видео мы выделяем процедуры arraying трансгенных эмбрионов в пластинах многоямного на 24hpf и добавление небольших молекул (BCI), который hyperactivates FGF сигнализации<sup> 3</sup>. Планшеты инкубируют в течение 6 часов с последующим добавлением в tricaine на анестезию личинки до автоматизированных изображений на Molecular Devices ImageXpress Ультра лазерной сканирующей конфокальной ЖКХ читателя. Изображения обрабатываются Definiens разработчика программного обеспечения с использованием технологий Познание сети алгоритм, который мы разработали для выявления и количественной оценки экспрессии GFP в головах трансгенных эмбрионов. В этом примере мы подчеркиваем способности алгоритма для измерения дозозависимый эффект BCI на GFP репортер экспрессии генов в обработанных эмбрионов.
Основным фактором, ограничивающим производительность экранов данио химических является отсутствие методологии систематического процесса 96-луночных планшетах для работы с изображениями и анализа. Потому что образы многоклеточные организмы являются сложными, низкий контраст и разнородные по своей природе, существующие алгоритмы анализа изображений не в состоянии обнаружить и количественно конкретных структур внутри организма. Часто публикуемые экраны данио химических поэтому включать визуальный осмотр отдельных скважин по выделенным персонала на всей процедуры. Как правило, это предотвращает поколения численных показаний и полное архивирование экранных изображений и данных. Кроме того, руководство оценки устраняет несколько ключевых преимуществ на основе образа скрининга, а именно способность провести ретроспективный анализ характеристик экрана, изучить фенотипические изменения, которые не были в центре внимания скрининга кампании (например, токсичность или пороки развития), а также крест ссылка отбора данных с прошлым или будущим экранов с помощью той же библиотеки соединения.
В данном отчете мы обращаем внимание методологии автоматизированного визуализации и анализа эмбрионов данио в виде пластин многоямного без вмешательства пользователя. Мы автоматизированного захвата изображения на лазерном ImageXpress Ультра сканирующей конфокальной читателя (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), чтобы изображение Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 эмбрионов в 96 луночных планшетах и разработан алгоритм анализа изображений на основе познания Definiens "Сетевые технологии, что количественно GFP выражение в головах трансгенных эмбрионов. Метод поставляются градуированные ответы и количественно в естественных условиях деятельности маленькая молекула активатора FGF сигнализации. Аналогичные результаты были получены с epifluorescence основе ArrayScan II (Cellomics Inc, Питтсбург PA) документирования, что это возможно реализовать автоматизированные захвата изображений из эмбрионов данио на различных коммерчески доступных читателям пластины 2. Разработка методологии для автоматического анализа изображений многоклеточного организма отпала необходимость визуального забив на человека-наблюдателя и позволило поколения и архивирование цифровых данных и изображений для ретроспективного анализа и сравнения с будущими экранов.
Эта работа финансируется за счет NICHD / NIH (1R01HD053287), чтобы Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), чтобы Фогт, и NHLBI / NIH (1R01HL088016), чтобы Цанг.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |