Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.
Biz zebrafish embriyolar FGF / RAS / MAPK yolağı modüle küçük moleküller tanımlamak için görüntü tabanlı yüksek içerik tarama (HCS) metodolojisi uygulama göstermektedir. Zebra balığı embriyosu, in vivo yüksek içerikli kimyasal ekranlar için ideal bir sistem. 1 gün eski embriyo yaklaşık 1 mm çapında ve 96-kuyu plakalar, yüksek verim tarama için standart bir format içine kolayca dizilmiş olabilir. Gelişimin ilk gününde, embriyolar, böylece embriyogenez sırasında doku oluşumu görselleştirme sağlayan en önemli organların en şeffaf. Özellikle otomatik görüntü toplama ve analiz geliştirme zebrafish kimyasal ekranların tam otomasyon, ancak hala bir sorundur. Biz daha önce FGF aktivite kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden transgenik muhabir hattı oluşturulmuş ve kimyasal ekranları kendi programını gösterdi<sup> 1</sup>. Yüksek verim tüm organizmanın ekranları için metodoloji kurmak için, biz 24-48 saat sonra döllenme (hpf) 96-kuyucuğu zebrafish embriyoların otomatik görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirdi<sup> 2</sup>. Bu video 24hpf multiwell tabak içine transgenik embriyolar arraying ilişkin usul vurgulayın ve küçük bir molekül (BCI) FGF sinyalizasyon hyperactivates ek<sup> 3</sup>. Plakalar tricaine Moleküler Aygıtlar ImageXpress Ultra lazer tarama konfokal HCS okuyucu otomatik görüntüleme önce larva uyutmak için ek takip 6 saat inkübe edilir. Görüntüler transgenik embriyoların başkanları GFP ifade algılamak ve ölçmek için geliştirilen bir Biliş Ağ Teknolojisi algoritması kullanılarak Definiens Developer yazılımı tarafından işlenir. Bu örnekte BCI tedavi edilen embriyolar GFP muhabiri gen ekspresyonu üzerine doza bağımlı etkileri ölçmek için algoritma yeteneği vurgulayın.
Zebrafish kimyasal ekranların verimini sınırlayan en önemli faktör, sistematik bir süreç görüntüleme ve analiz için 96-kuyucuğu metodoloji eksikliği. Çok hücreli organizmalarda görüntüleri karmaşık, düşük kontrast ve heterojen doğası nedeniyle, mevcut görüntü analizi algoritmaları organizma içinde özel yapıları tespit etmek ve ölçmek için başarısız olur. En yayımlanan zebrafish kimyasal ekranları bu nedenle işlem boyunca özverili personeli tarafından bireysel kuyuların gözle muayene içerir. Bu genellikle sayısal okuma üretim ve tam bir ekran görüntüleri ve veri arşivleme önler. Ayrıca, elle değerlendirme, yani görüntü tabanlı tarama, ekran performansı retrospektif analizler yapmak için tarama kampanyası (örneğin, toksisite ya da gelişimsel kusurlar) birincil odak fenotipik değişiklikleri incelemek ve çapraz yeteneği çok önemli avantajları ortadan kaldırır geçmiş veya gelecekteki ekranlar ile aynı bileşik kitaplığı kullanılarak referans tarama verileri.
Bu yazıda, kullanıcının müdahalesine gerek kalmadan zebrafish embriyoların multiwell plakalar otomatik görüntüleme ve analiz için metodoloji vurgulayın. Biz 96 kuyucuğu pt6 embriyo ve Definiens Biliş Ağ Teknolojisi ki sayısal GFP dayalı bir görüntü analizi algoritması geliştirilen görüntü Tg (d2EGFP dusp6): konfokal okuyucu (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA) tarama ImageXpress Ultra lazer otomatik görüntü yakalama transgenik embriyoların başkanları ifade. Yöntemi kademeli yanıtları teslim ve FGF sinyalizasyon küçük bir molekül aktivatör in vivo aktivite nicel. Zebrafish embriyoların 2, piyasada bulunan plaka okuyucuları çeşitli otomatik görüntü yakalama uygulamak mümkün olduğunu belgeleyen Epifloresans tabanlı ArrayScan II (Cellomics A.Ş., Pittsburgh, PA) ile benzer sonuçlar elde edildi . Çok hücreli organizma görüntüler otomatik olarak analiz etmek için metodoloji geliştirilmesi, insan bir gözlemci tarafından görsel skorlama için ihtiyaç ortadan nesil ve gelecek ekranları ile retrospektif analizi ve karşılaştırmalar için sayısal veri ve görüntü arşivleme etkin.
Bu çalışma Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) Vogt ve NHLBI / NIH (1R01HL088016) Tsang için NICHD / NIH (1R01HD053287) tarafından finanse edilmektedir.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |