Analyse immunocytochimique des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un appareil Self-Made Cytospin
Summary
Suspension coloration immunocytochimique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour les marqueurs de surface cellulaire (SSEA-3/SSEA-4) a été réalisé basée sur l'utilisation d'un appareil de self-made cytospin de créer une monocouche de cellules d'observation et de quantification.
Abstract
Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui incluent des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et humains cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) sont des sources de cellules passionnante en raison de leur auto-renouvellement illimité des capacités et leur potentiel de se différencier en plusieurs types cellulaires. L'état pluripotent des hPSCs est généralement évaluée par des techniques telles que qPCR, immunocytochimie, et par d'autres<em> In vitro</em> Et<em> In vivo</emLes stratégies de différenciation> en plusieurs types cellulaires. Parmi ces derniers, des techniques immunocytochimiques ont été développés pour la caractérisation de routine de l'état indifférencié de hPSCs basée sur l'analyse des biomarqueurs candidats intracellulaire et la surface des cellules. Compte tenu du fait que grandir en tant hPSCs colonies, des problèmes surgissent dans la quantification de l'expression de ces marqueurs au niveau des cellules individuelles sur une base routinière. Analyses par cytométrie en flux permettent d'aborder cette question, mais nécessitent un nombre de cellules et l'utilisation de réactifs qui ne sont normalement pas propice à l'évaluation de la qualité de contrôle de routine des cultures HPSC. Ainsi, le développement de moyens pratiques et reproductibles de créer des échantillons de cellules monocouche avec intégrité préservée pour l'évaluation marqueur a de nombreux avantages en matière de recherche sur les cellules souches. Cela profite grandement analyse immunocytochimique des cellules individuelles en raison de la monocouche peut être facilement observés et quantifiés pour l'expression de marqueurs spécifiques. Pour atteindre cet objectif, un appareil de self-made cytospin a été construit et optimisé pour une utilisation avec la coloration immunocytochimique. Deux marqueurs de surface cellulaire (SSEA3/SSEA4) d'expression ont été analysés dans une ligne de la variante BG01 cellules souches dans le but de ce protocole.
Protocol
Discussion
Aux fins de notre laboratoire, un plat de 35mm de cultures de cellules souches cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est alloué pour la procédure de marquage immunocytochimique pour une utilisation avec l'appareil cytospin. Les cellules sont ensuite collectées par le biais du enzymatique repiquage, en supprimant autant de la couche MEF que possible, en une suspension à cellule unique. Si plus une isolation efficace de cellules souches à partir de la couche MEF est souhaitée, les colonie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un financement partiel de ce travail a été fourni par NSF-CAREER 0744556 (Rao) et une bourse par le biais de l'éducation VCU-HHMI Programme de sciences et de la recherche (Pascual).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
Referências
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
