Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer
Summary
Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd door<em> In-vitro</em> Evolutie methoden op basis van affiniteit voor een specifieke doelgroep. Aptameren zijn moleculaire herkenning gereedschappen met veelzijdige therapeutische, diagnostische en wetenschappelijke toepassingen. Tonen we methoden voor de selectie van aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve, leeftijd-afhankelijk, neurodegeneratieve aandoening met een verraderlijke cursus die maakt haar presymptomatische diagnose moeilijk 1. Definitieve diagnose AD wordt pas postmortem, dus tot oprichting van presymptomatische, vroege diagnose van AD is cruciaal voor het ontwikkelen en beheren van effectieve therapieën 2,3.
Amyloid β-eiwit (Aß) staat centraal in AD pathogenese. Oplosbaar, oligomere Aß assemblages worden verondersteld om neurotoxiciteit onderliggende synaptische dysfunctie en neuronen verlies zullen beïnvloeden in AD 4,5. Verschillende vormen van oplosbare Aß vergaderingen zijn beschreven, echter, hun onderlinge relaties en de relevantie voor AD etiologie en pathogenese zijn complex en niet goed begrepen 6. De specifieke moleculaire herkenning instrumenten kan ontrafelen van de relaties tussen Aß assemblies en vergemakkelijken detectie en karakterisatie van deze vergaderingen vroeg in het ziekteverloop voordat de symptomen ontstaan. Moleculaire herkenning vertrouwt vaak op antilichamen. Echter, een andere klasse van moleculaire herkenning tools, aptameren, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van antilichamen 7,8. Aptameren worden oligonucleotiden gegenereerd door in-vitro selectie: systematische ontwikkeling van liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) 9,10. SELEX is een iteratief proces dat vergelijkbaar is met de evolutietheorie van Darwin maakt selectie, versterking, verrijking, en bestendiging van een onroerend goed, bijvoorbeeld, Avid, specifieke, ligand binding (aptameren) of katalytische activiteit (ribozymen en DNAzymes).
Ondanks de opkomst van aptameren als hulpmiddelen in de moderne biotechnologie en de geneeskunde 11, zijn ze nog onvoldoende benut in het amyloid veld. Weinig RNA of ssDNA aptameren zijn geselecteerd tegen diverse vormen van prion-eiwitten (PrP) 12-16. Een RNA-aptameer gegenereerd tegen recombinant bovine PrP bleek de runder-PrP β 17 herkennen, een oplosbaar, oligomere, β-sheet-rijke conformationele variant van volledige lengte PrP dat amyloïd fibrillen 18 vormen. Aptameren gegenereerd met behulp van monomere en diverse vormen van fibrillair β 2-microglobuline (β 2 m) bleken fibrillen bepaalde andere amyloidogenic eiwitten binden naast β 2 m fibrillen 19. Ylera et al.. beschreven RNA aptameren geselecteerd op grond van geïmmobiliseerd monomere Aβ40 20. Onverwacht, deze aptameren gebonden fibrillair Aβ40. Al met al deze gegevens maken een aantal belangrijke vragen op. Waarom heeft aptameren geselecteerd op grond van monomere eiwitten herkennen hun polymere vormen? Zou aptameren tegen monomere en / of oligomere vormen van amyloidogenic eiwitten worden verkregen? Om deze vragen te beantwoorden, hebben we geprobeerd om aptameren te selecteren voor covalent-gestabiliseerd oligomere Aβ40 21 gegenereerd met behulp van foto-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) 22,23. Net als bij eerdere bevindingen 17,19,20, deze aptameren reageerde met fibrillen van Aß en enkele andere amyloidogenic eiwitten waarschijnlijk het herkennen van een mogelijk gemeenschappelijke amyloid structurele aptatope 21. Hier presenteren we de SELEX methodologie die wordt gebruikt bij de productie van deze aptameren 21.
Protocol
Discussion
Het uitgangspunt van het SELEX proces is de synthese van een willekeurige oligonucleotide bibliotheek meestal met daarin 10 12 -10 15 sequenties. In DNA SELEX, deze bibliotheek direct wordt gebruikt na een ssDNA pool wordt gegenereerd, terwijl in RNA SELEX, toonde hier, is het ssDNA bibliotheek eerst omgezet in een RNA-pool enzymatisch door in-vitro transcriptie. Vervolgens wordt SELEX iteratief uitgevoerd, waarbij elke cyclus bestaat uit de belichting en binding van oligonucleotiden aan h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies AG030709 van NIH / NIA en 07-65798 van het California Department of Public Health. Wij erkennen Margaret M. Condron voor peptide synthese en aminozuur analyse, dr. Elizabeth F. Neufeld voor het helpen en ondersteunen van de eerste stappen van het project, Dr Chi-Hong Chen B. voor het verlenen van steun en reagentia, en Dr Andrew D . Ellington voor nuttige discussies.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
Referências
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
