Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения
Summary
Количественная оценка ДНК двухцепочечной полосы использованием γH2AX формирование как молекулярный маркер стал бесценным инструментом в области радиационной биологии. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов после контакта клеток к радиации.
Abstract
ДНК двунитевых разрывов (ДР), которые индуцируются или эндогенных процессов обмена веществ или экзогенными источниками, являются одним из самых критических повреждений ДНК в отношении выживания и сохранения целостности генома. Ранний ответ на индукции ДР является фосфорилирование гистонов H2A вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX<sup> 1</sup>. После индукции ДР, H2AX быстро фосфорилируется фосфатидил-inosito 3-киназы (PIKK) семейство белков, атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM), ДНК-протеинкиназа каталитической субъединицы и банкоматов и RAD3 связанных (ATR)<sup> 2</sup>. Как правило, только несколько пар оснований (п.о.) вовлечены в DSB, однако, имеется значительное усиление сигнала, учитывая важность хроматина изменения в ДНК сигнализации повреждения и ремонта. Фосфорилирование H2AX опосредованное преимущественно банкоматов распространяется на смежные области хроматина, затрагивая приблизительно 0,03% от общего числа сотовых H2AX в DSB<sup> 2,3</sup>. Это соответствует фосфорилирования около 2000 молекул H2AX охватывающих ~ 2 Mbp регионы хроматина окружающих сайте DSB и приводит к образованию дискретных γH2AX очаги, которые могут быть легко визуализировать и количественно с помощью иммунофлуоресценции микроскопии<sup> 2</sup>. Потеря γH2AX на DSB отражает ремонт, однако, есть некоторые разногласия относительно того, что определяет полный ремонт ДР, было предложено, что воссоединение обеих цепей ДНК является адекватным тем не менее, он также предложил, чтобы повторно удостоверений о исходное состояние хроматина уплотнения необходимо<sup> 4-8</sup>. Исчезновением γH2AX включает в себя по крайней мере частично, путем дефосфорилирования фосфатазы, фосфатазы 2А и фосфатазы 4C<sup> 5,6</sup>. Кроме того, удаление γH2AX путем перераспределения связанных гистонов обмена с H2A.Z был вовлечен<sup> 7,8</sup>. Важно отметить, что количественный анализ γH2AX очагов привело к широкому кругу приложений в медицинских и ядерных исследований. Здесь мы демонстрируем, наиболее часто используемый метод иммунофлюоресценции для оценки первоначальных повреждений ДНК, обнаружения и количественного определения γH2AX очагов в γ-облученных приверженцем кератиноцитов человека<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
После воздействия ионизирующего излучения (γ-лучи), γH2AX очагов форме быстро и очагов номера достигают максимума между 30-60 минут 2. Таким образом, наша 1 час после облучения момент времени отражает начальное образование DSB. Мы использовали клинически значимые дозы облучения 2 Гр для …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
