原位贴壁和非贴壁的哺乳动物细胞的亚细胞分馏
Summary
允许在原位显微镜盖玻片上的哺乳动物细胞的亚细胞分馏蛋白定位可视化。
Abstract
蛋白质的功能是紧密耦合的蛋白定位。虽然一些蛋白质被限制到特定的位置或亚细胞车厢，许多蛋白质是自由扩散，作为一个自由交流的的一个亚群，是与特定的亚细胞域或结构紧密相关的人口。允许的可视化，在原地的亚细胞分馏蛋白质的条块分割，还可以揭示蛋白质亚群，定位于特定的结构。例如，去除可溶性的细胞质蛋白和松散举行的核蛋白质可以揭示一些与染色质的转录因子的稳定协会。随后的DNA消化，可以揭示在某些情况下，协会与网络，统称为核脚手架或核基质蛋白和RNA的。
在这里，我们描述了在显微镜盖玻片壁和非贴壁的哺乳动物细胞原位分馏过程中所需的步骤。使用特异性抗体或荧光融合蛋白和荧光显微镜，可以达到蛋白质的可视化。抗体和/或行为，作为特定的车厢或结构的标记的荧光染料允许蛋白定位进行详细的映射。原位分馏也可以结合免疫印迹比较每个分数中蛋白质的数额。这个简单的生化方法可以揭示协会，否则仍未被发现。
Protocol
一，准备进行分馏本节介绍了聚- L -赖氨酸涂层显微镜的盖玻片和细胞附着之前分馏的准备。如果需要的细胞可以瞬时转染与蛋白表达载体之前或之后附件。 A.制备聚- L -赖氨酸涂布盖玻片准备一个1mg/ml的聚- L -赖氨酸的蒸馏水溶液。 清洁盖玻片大衣与聚- L -赖氨酸孵化摇椅平台上至少1小时的解决方案，在22 ° C。 用无菌蒸馏水冲洗涂?…
Discussion
共同的问题和建议：
在清洗过程中的全部或大部分细胞都将丢失。在洗涤步骤中的液体必须避免盖玻片的6孔板边缓慢加入。同样的液体，应仔细倾斜板中删除，并慢慢地移液多余的液体。使用聚- L -赖氨酸涂布盖玻片，可提高细胞粘附。
基因组DNA是没有完全消化。对于某些类型的细胞的DNA酶I消化步骤，可能需要进行扩展和/或DNA酶I浓度增加，以达到彻…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai Nazefah阿卜杜勒哈米德感谢泰王国政府和马来西亚政府，分别为博士奖学金。这项工作是由威康信托项目荣获PSJ和KG授予。我们也感谢布里斯托尔大学欧胜生物成像设施。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Referências
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Sawasdichai, A., Chen, H., Abdul Hamid, N., Jayaraman, P., Gaston, K. In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (41), e1958, doi:10.3791/1958 (2010).