In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen
Summary
In situ subzellulären Fraktionierung von Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser ermöglicht die Visualisierung von Protein-Lokalisierung.
Abstract
Protein-Funktion ist eng mit Proteinlokalisierung gekoppelt. Obwohl einige Proteine an einen bestimmten Ort oder subzellulären Kompartiment beschränkt sind, sind viele Proteine als frei diffundierenden Bevölkerung in freien Austausch mit einer Sub-Population, die eng mit einem bestimmten subzellulären Domäne oder der Struktur verbunden ist. In situ subzelluläre Fraktionierung ermöglicht die Visualisierung von Protein Kompartimentierung und kann auch zeigen, Protein Sub-Populationen, die auf bestimmte Strukturen zu lokalisieren. Zum Beispiel kann die Entfernung der löslichen zytoplasmatischen Proteine und locker gehaltenen nuklearen Proteine zeigen die stabile Assoziation von einigen Transkriptionsfaktoren mit Chromatin. Nachfolgende Verdauung von DNA kann in vielen Fällen den Zusammenhang mit dem Netzwerk von Proteinen und RNA, die zusammen den nuklearen Gerüst oder Kernmatrix bezeichnet wird.
Hier beschreiben wir die Schritte während der in situ-Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser erforderlich. Protein-Visualisierung kann mit Hilfe spezifischer Antikörper oder fluoreszierende Fusionsproteine und Fluoreszenz-Mikroskopie werden. Antikörper und / oder fluoreszierende Farbstoffe, die als Marker für spezifische Abteilungen oder Strukturen zu agieren Proteinlokalisierung im Detail abgebildet werden. In situ-Fraktionierung kann auch mit Western-Blot auf die Mengen an Protein, das in jeder Fraktion vergleichen kombiniert werden. Diese einfache biochemische Verfahren deckt Verbände, die sonst bliebe unerkannt.
Protocol
Discussion
Häufige Probleme und Anregungen:
Alle oder die meisten Zellen sind beim Waschen verloren. Während Waschschritte Flüssigkeiten müssen langsam auf die Seite der 6-Well-Platte zu vermeiden das Deckglas hinzugefügt werden. Auch Flüssigkeiten sollten durch vorsichtiges Kippen der Platte entfernt werden und langsam Abpipettieren überschüssige Flüssigkeit. Zelladhäsion vergrößert Verwendung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser werden.
Genomic DNA nicht vol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai und Nazefah Abdul Hamid sind dankbar, dass die thailändische Regierung und der Regierung von Malaysia jeweils für Ph.D. Stipendien. Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Projekt Zuschuss für PSJ und KG finanziert. Wir sind auch dankbar für die University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Referências
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