In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti
Summary
In situ frazionamento subcellulare delle cellule di mammifero su vetrini microscopio permette la visualizzazione della localizzazione delle proteine.
Abstract
Funzione della proteina è intimamente unita alla localizzazione delle proteine. Sebbene alcune proteine sono limitate a una posizione specifica o compartimento subcellulare, molte proteine sono presenti come una popolazione liberamente diffondere in libero scambio con una sotto-popolazione che è strettamente associata a un determinato dominio o struttura subcellulare. Frazionamento subcellulare in situ permette la visualizzazione di compartimentalizzazione delle proteine e può anche rivelare le proteine sotto-popolazioni che si localizzano a strutture specifiche. Per esempio, la rimozione di proteine solubili citoplasmatici e vagamente tenuto proteine nucleari in grado di rivelare l'associazione stabile di alcuni fattori di trascrizione con cromatina. Successiva digestione del DNA possono in alcuni casi rivelano associazione con la rete di proteine e RNA che viene collettivamente definito il nucleare patibolo o matrice nucleare.
Qui si descrivono le operazioni necessarie durante il frazionamento in situ di cellule di mammifero aderenti e non aderenti a lamelle microscopio. Visualizzazione di proteine può essere ottenuto utilizzando anticorpi specifici o proteine di fusione fluorescenti e microscopia a fluorescenza. Anticorpi e / o coloranti fluorescenti che agiscono come marcatori per specifici comparti o strutture consentono la localizzazione delle proteine da mappare nel dettaglio. Frazionamento in situ può anche essere combinato con western blotting per confrontare la quantità di proteine presenti in ogni frazione. Questo semplice approccio biochimico in grado di rivelare le associazioni che altrimenti rimarrebbero inosservati.
Protocol
Discussion
Problemi comuni e suggerimenti:
Tutti o la maggior parte delle cellule sono persi durante il lavaggio. Durante le fasi di lavaggio deve essere aggiunto lentamente al lato del 6-pozzetti evitando il coprioggetto. Allo stesso modo i liquidi devono essere rimossi con attenzione inclinando la piastra e lentamente pipettaggio l'eccesso di liquido. L'adesione cellulare può essere aumentata mediante coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina.
DNA genomico non è del …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai e Nazefah Abdul Hamid grati al governo tailandese e il Governo della Malaysia, rispettivamente per dottorato di ricerca Borse di studio. Questo lavoro è stato finanziato da un progetto Wellcome Trust sovvenzione concessa a PSJ e KG. Siamo anche grati per l'Università di Bristol Fondo Bioimmagini Wolfson.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Referências
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