In situ subcellulära Fraktionering av vidhäftande och icke-häftande däggdjursceller
Summary
In situ subcellulära fraktionering av däggdjursceller på mikroskop täckglas tillåter visualisering av protein lokalisering.
Abstract
Proteiners funktion är intimt kopplad till protein lokalisering. Även om vissa proteiner är begränsade till en viss plats eller subcellulära fack, många proteiner är närvarande som ett fritt diffuserande befolkningen i fritt utbyte med en delpopulation som är tätt förknippad med en viss subcellulära domän eller struktur. In situ subcellulära fraktionering tillåter visualisering av protein uppdelning och kan också avslöja protein delpopulationer som lokaliserar till specifika strukturer. Till exempel kan borttagning av lösliga cytoplasmiska proteiner och löst höll nukleära proteiner avslöja stabil sammanslutning av vissa transkriptionsfaktorer med kromatin. Efter rötning av DNA kan i vissa fall avslöja samband med det nätverk av proteiner och RNA som kollektivt kallas den nukleära schavotten eller nukleära matris.
Här beskriver vi de åtgärder som krävs vid in situ fraktionering av anhängare och icke-häftande däggdjursceller på mikroskop täckglas. Protein visualisering kan uppnås med hjälp av specifika antikroppar eller fluorescerande proteiner fusion och fluorescensmikroskopi. Antikroppar och / eller fluorescerande färger som fungerar som markörer för specifika utrymmen eller strukturer kan protein lokalisering kan kartläggas i detalj. In situ fraktionering också kan kombineras med Western blotting för att jämföra mängden protein som finns i varje fraktion. Denna enkla biokemiska angreppssätt kan avslöja föreningar som annars skulle förbli oupptäckta.
Protocol
Discussion
Vanliga problem och förslag:
Alla eller de flesta av cellerna försvinner vid tvätt. Under tvättsteg vätskor måste tillsättas långsamt till sidan av 6-brunnar undvika täckglas. Likaså vätskor bör avlägsnas genom att försiktigt luta plattan och långsamt pipettera bort överflödig vätska. Celladhesion kan ökas med hjälp av poly-L-Lysin belagda täckglas.
Genomisk DNA är inte helt smält. För vissa celltyper i DNAse jag matsmältningen steg kan beh?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anyaporn Sawasdichai och Nazefah Abdul Hamid är tacksamma mot den thailändska regeringen och Malaysias regering respektive för doktorsexamen Stipendier. Detta arbete har finansierats av ett Wellcome Trust projektbidrag beviljas till PSJ och KG. Vi är också tacksamma till University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |
Referências
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
