Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei</em
Summary
Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur in<em> Trypanosoma brucei</em>, Die zijn eigen in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extensie, die zal worden beschreven.
Abstract
De telomeer G-overhang structuur heeft al in vele eukaryoten, met inbegrip gist, gewervelde dieren, en Trypanosoma brucei. Het dient als substraat voor telomerase voor de novo telomeren DNA-synthese en is daarom belangrijk voor telomeren onderhoud. T. brucei is een protozoaire parasiet die veroorzaakt slaapziekte bij de mens en nagana bij rundvee. Eenmaal besmet zoogdier gastheer, T. brucei cel schakelt regelmatig haar oppervlakte-antigeen te ontwijken van de gastheer immuunsysteem aan te vallen. We hebben onlangs aangetoond dat de T. brucei telomeer structuur speelt een essentiële rol in de regulatie van oppervlakte-antigeen genexpressie, die cruciaal is voor T. brucei pathogenese. Echter, T. brucei telomeer structuur niet is uitgebreid als gevolg van de beperking van de methoden voor de analyse van deze gespecialiseerde structuur bestudeerd. We hebben nu met succes heeft de autochtone in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extension methods voor het onderzoek van de telomeren G-overhang structuur en een adapter ligatie methode voor de bepaling van de telomeren terminal nucleotide in T. brucei cellen. Hier zullen we beschrijven de protocollen in detail en vergelijken hun verschillende voordelen en beperkingen.
Protocol
Discussion
Trypanosoma brucei veroorzaakt slaapziekte bij de mens. Deze ziekte, indien onbehandeld, is onvermijdelijk fataal. T. brucei cellen in zoogdieren gastheren ondergaan antigene variatie regelmatig, zodat de gastheer immuunsysteem aanvallen 7 te ontwijken. Daarom is het erg moeilijk uit te roeien T. brucei cellen zodra een infectie wordt vastgesteld. We hebben onlangs aangetoond dat telomeren een belangrijke rol spelen in de regulatie van de expressie van T. brucei oppervlakte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dr Carolyn Price bedanken voor de wetenschappelijke discussies en inzichtelijke suggesties. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie AI066095 (PI: Bibo Li).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
| Exo I | NEB | M0293 | ||
| Exo T | NEB | M0265 | ||
| T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
Referências
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
