Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.
Oligodendrociti sono cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Per la terapia cellulare rigenerativa nelle malattie demielinizzanti, c'è notevole interesse nel derivare una popolazione di stirpe pura-committed cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) per il trapianto. OPC si distinguono per l'attività del Olig2 fattore di trascrizione e l'espressione superficiale di un NG2 proteoglicani. Utilizzando la GFP-Olig2 (G-Olig2) topo con cellule staminali embrionali (Mesc) linea reporter, abbiamo ottimizzato le condizioni per la differenziazione dei mESCs in Olig2 GFP + + + NG2 OPC. Nel nostro protocollo, per prima cosa descrivere la generazione dei corpi embrionali (EBS) da mESCs. In secondo luogo, si descrive il trattamento di Mesc derivati EBS con piccole molecole: (1) acido retinoico (RA) e (2) un Sonic hedgehog (Shh) purmorphamine agonista (Pur) in condizioni cultura definita per dirigere la differenziazione EB nel lignaggio oligodendrogliali. Con questo approccio, OPC può essere ottenuto con alta efficienza (> 80%) in un periodo di tempo di 30 giorni. Cellule derivate da mESCs in questo protocollo sono fenotipicamente simile a OPC derivati da colture cellulari primarie. Il Mesc derivati OPC non mostrano la proprietà spiking descritto per una sottopopolazione di OPC cervello in situ. Per studiare questa proprietà elettrofisiologiche, si descrive la generazione di spiking Mesc derivati OPC da ectopica esprimendo Na<sub> V</sub> 1,2 subunità. Le cellule spiking e nonspiking ottenuti da questo protocollo contribuirà a studi funzionali anticipo sui due sottopopolazioni di OPC.
Le cellule staminali embrionali (ESC), isolate da un embrione blastocisti, possono differenziarsi in tutte le linee cellulari dell'organismo 3, 4, fornendo un sistema di modello in vitro per lo studio precoce sviluppo dei mammiferi, compresa la specificazione degli oligodendrociti. mESCs hanno dimostrato di differenziarsi in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) con il trattamento di Sonic hedgehog (Shh) 5. Inoltre, il Shh differenziazione, indotta dal mESCs OPC conserva i tempi corretti osservata nello sviluppo embrionale 6. Quindi, la natura del differenziamento in vitro OPC da mESCs è considerato coerente con quanto si è appreso dal vivo in fase di sviluppo. Qui, utilizzando il piccolo molecole RA e l'Pur agonista Shh, abbiamo differenziato con successo il G-Olig2 mESCs in Olig2 GFP + + + NG2 OPC con alta efficienza.
OPC, caratterizzato dall'espressione di proteoglicani NG2 7 e l'elica-loop-elica fattore di trascrizione Olig2 8, generare oligodendrociti nel sistema nervoso centrale sviluppo e maturo, dove essi costituiscono una percentuale significativa (~ 5%) delle cellule totali e sono la principale tipo di cellule proliferanti 9. Per quasi due decenni, i ricercatori hanno dimostrato Na canali V sono espressi in una sottopopolazione di OPC e può essere attivato su depolarizzazione 10, 11. Inoltre, una recente osservazione sorprendente 9 è stato che nel sistema nervoso centrale di ratto in situ della sostanza bianca, OPC (~ 50%) ha generato un potenziale d'azione quando depolarizzata seconda l'espressione del sodio voltaggio-dipendenti (Na V) canali, e quindi potrebbe essere suddiviso in spiking e nonspiking sottopopolazioni. Tuttavia, le funzioni di queste proprietà spiking sono ancora largamente sconosciuti. Abbiamo scoperto che, elettrofisiologico, la Mesc derivati OPC differenziato con il protocollo di Shh-dipendente, non erano la stessa de OPC cervello in situ. Dopo aver introdotto subunità Na V 1.2, questi silenziosi Mesc derivati OPC sono state in grado di spike.
Così, la spiking / nonspiking Mesc derivati OPC e il protocollo di differenziazione descritto qui può facilitare (1) studiando le differenze funzionali tra spike e nonspiking OPC, (2) fattori di screening in grado di promuovere il canale di espressione di sodio nel Mesc derivati OPC, ( 3) sviluppare e ottimizzare il protocollo di differenziazione delle OPC da ESC umane o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalle concessioni a WD dal National Institutes of Health (RO1 NS059043 e RO1 ES015988), la National Multiple Sclerosis Society, la Roche Fondazione per la ricerca anemia, Feldstein Medical Foundation, e la Shriners Hospitals for Children.
Vorremmo ringraziare il Dr. Pleasure David e Jennifer aereo per i suggerimenti. Si dichiara non interessi contrastanti relativi a questo articolo.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |